肝癌細胞不同制懸方法建立裸鼠移植瘤模型的比較

裘鎧杰，李大川，胡彥建，李紅影，吳德全，張鳳民，胡彥華

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院1.普通外科;2.消化內(nèi)科，黑龍江哈爾濱150086;3.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室;4.哈爾濱醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院微生物教研室

肝癌是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全球發(fā)病率男性位居第五位，女性位居第七位，而其病死率男性排第二位，女性排第六位，嚴重威脅著人們的健康和生命［1］，雖然其治療取得了可喜的進展，但是總體治療效果仍不明顯［2-3］。肝癌動物模型是研究肝癌發(fā)生、生長及轉移機制的重要手段之一，也是尋求抗肝癌治療新途徑的有效方法之一［4］。目前，肝癌裸鼠移植模型是人體外最接近人類肝癌的整體實驗模型，因此成為肝癌實驗研究理想的動物模型，尤其利用肝癌細胞直接注射接種建立肝癌裸鼠皮下移植瘤模型［5-6］及肝癌原位移植瘤模型［7］的方法已經(jīng)得到了廣泛的應用。但是，有關肝癌細胞接種前采用何種液體制懸未見明確報道。為此，本文選用具有代表性的高侵襲性人肝癌細胞株MHCC-97H，以不同的液體對肝癌細胞稀釋制懸后接種于裸鼠，制備肝癌裸鼠荷瘤模型(皮下和原位模型)，探討模型制備的最佳肝癌細胞制懸方法，為肝癌研究提供有效的動物模型。

1 材料與方法

1.1 人肝癌細胞株 高侵襲性人肝癌細胞株MHCC-97H 由上海復旦大學肝癌研究所饋贈。

1.2 裸鼠 雄性BALB/c-nu 裸小鼠60 只，4 ～5 周齡，體質量12 ～14 g(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)。飼養(yǎng)于哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗室中，飼料、飲水、墊料、籠具均經(jīng)高壓蒸汽滅菌后使用，操作人員嚴格執(zhí)行SPF 級實驗動物操作規(guī)程。許可證編號:SCXK(京)2012-0001。

1.3 細胞培養(yǎng) 細胞置于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%特級胎牛血清(上海博升生物技術有限公司代購)的DMEM 高糖培養(yǎng)液，每2 d全量換液，顯微鏡下觀察細胞處于對數(shù)生長期后用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3 傳代。

1.4 皮下移植瘤模型的建立方法 將30 只裸鼠隨機分為3 組，分別采用PBS 緩沖液(PBS 組)、無血清DMEM 溶液(DMEM 組)和含10%血清的DMEM 溶液(血清DMEM 組)制懸肝癌細胞，每組10 只。在細胞呈對數(shù)生長期時，收集培養(yǎng)的MHCC-97H 細胞，PBS組用PBS 緩沖液稀釋制備腫瘤細胞懸液，調(diào)整濃度均為1 ×107個活細胞/ml，75%酒精消毒裸鼠背部，取0.2 ml注入裸鼠皮下;DMEM 組用無血清的DMEM 溶液稀釋肝癌細胞制懸;血清DMEM 組用含10%血清的DMEM 溶液稀釋肝癌細胞制懸，其余操作與PBS 組相同。接種完成后每日觀察裸鼠生存狀況和精神狀態(tài)，第2、3、4 周各用游標卡尺測量一次皮下瘤長短徑，按標準公式計算瘤體積:V=L ×W2×0.52(其中L 為最長徑，W 為最短徑)，第4 周測量后當日，逐只剖取腫瘤，稱量，記錄瘤重并計算成瘤率。腫瘤組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察細胞和組織結構的變化。

1.5 原位移植瘤模型的建立方法 將30 只裸鼠平均隨機分為3 組，分別采用PBS 緩沖液(PBS 組)、無血清DMEM 溶液(DMEM 組)和含10%血清的DMEM 溶液(血清DMEM 組)制懸肝癌細胞，每組10 只。在細胞呈對數(shù)生長期時，收集培養(yǎng)的MHCC-97H 細胞。PBS 組用PBS 緩沖液稀釋制備腫瘤細胞懸液，調(diào)整濃度均為1 ×107個活細胞/ml，1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。沿鼠左肋緣下方開腹，充分暴露肝左葉，1 ml 無菌注射器抽取細胞懸液緩慢推進肝臟約150 μl，逐層用4-0 無損傷線縫合關腹。術后正常飲食，未應用抗生素;DMEM 組用無血清的DMEM 溶液稀釋腫瘤細胞制懸;血清DMEM 組用含10%血清的DMEM 溶液稀釋腫瘤細胞制懸，其余操作與PBS 組相同。接種完成后，每日觀察裸鼠生存狀況和精神狀態(tài)，4 周后逐只剖腹探查，肉眼下觀察有無肝臟原位腫瘤形成并計算成瘤率，腫瘤組織經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察細胞和組織結構的變化。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料應用x ±s 表示，計數(shù)資料應用率表示。計量資料的比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠皮下瘤的體積與瘤重的比較 3 組裸鼠均在1 周后開始出現(xiàn)肉眼可見的約1 mm 左右的腫瘤，質地偏硬，可活動，2 ～3 周后，腫瘤的生長速度有所加快，約4 周后，腫瘤的體積可增至1 cm3以上(見圖1)。處死裸鼠后取出瘤體，肉眼觀察:移植瘤為單個瘤塊，瘤體質地偏硬，顏色呈淡粉紅色，表面有血管分布(見圖2)。剖視為魚肉樣外觀，中心可見壞死灶;鏡下觀察:瘤體組織內(nèi)有大量深染巨核細胞，異形性明顯，多數(shù)見核分裂相(見圖3)。統(tǒng)計分析結果顯示，PBS 組、DMEM 組及血清DMEM 組的腫瘤體積及瘤重相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05，見表1)。

2.2 裸鼠皮下瘤模型成瘤率的比較 3 組裸鼠分別觀察4 周，全部存活。結果顯示，PBS 組的成瘤率為90%(9/10)，DMEM 組的成瘤率為100%(10/10)，血清DMEM 組的成瘤率為40%(4/10)，DMEM 組的成瘤率與PBS 組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，血清DMEM 組的成瘤率與PBS 組及DMEM 組相比，有明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

2.3 裸鼠原位瘤模型成瘤率的比較 3 組裸鼠術后生存狀況良好。4 周后，將裸鼠處死，開腹觀察肝臟大體情況，可見裸鼠肝臟表面密布大小不等白色腫瘤灶(見圖4)。有些腫瘤灶突出于肝臟表面形成較大質硬腫塊(見圖5)。組織切片HE 染色可見腫瘤灶散布于肝臟內(nèi)，大小不一，位于肝臟邊緣者較大，腫瘤細胞較正常肝臟細胞深染，核大，可見分裂相及多核，可見炎性細胞浸潤(見圖6)。結果顯示，PBS 組的成瘤率(90%)明顯高于DMEM 組(40%)及血清DMEM 組(20%)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，DMEM 組的成瘤率高于血清DMEM 組，但差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

圖1 皮下移植瘤模型外觀;圖2 皮下移植瘤肉眼觀圖;圖3 皮下移植瘤病理切片(100 ×)Fig 1 Human hepatoma carcinoma cell line subcutaneous xenograft;Fig 2 Gross observation of the subcutaneous xenograft tumor;Fig 3 Pathological observation of the subcutaneous xenograft tumor (100 ×)

表1 裸鼠皮下瘤體積與瘤重的比較(x±s)Tab 1 Comparison of volum and weight of the subcutaneous xenograft tumor (x±s)

圖4 裸鼠原位瘤多發(fā)灶大體觀;圖5 裸鼠原位瘤單發(fā)灶大體觀;圖6 原位移植瘤病理切片(100 ×)Fig 4 Multiple liver xenograft tumors in nude mice;Fig 5 Single liver xenograft tumor in nude mice;Fig 6 Pathological observation of the liver xenograft tumor (100 ×)

3 討論

肝癌是嚴重危害人類生命健康的臨床常見的惡性腫瘤之一，雖然目前通過綜合治療模式，使肝癌的5 年生存率有了顯著的提高，但是我國每年仍有約11 萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%，所以肝癌相關方面的研究對于我國乃至世界具有重大意義。肝癌的基礎與臨床研究迫切需要能真正模擬肝癌在人體內(nèi)自然生長、侵襲及轉移全部過程的動物模型。目前，肝癌裸鼠移植瘤模型是人體外最接近人類肝癌的整體實驗模型。雖然經(jīng)過學者們多年來的實驗摸索，肝癌裸鼠移植瘤模型已經(jīng)比較成熟，但仍會有移植成功率不高、潛伏期長以及存活率低等情況出現(xiàn)，目前學者們認為影響移植成功的因素主要有:鼠的品系、周齡、移植部位、移植細胞數(shù)、生長環(huán)境等［8-9］，但是尚未有研究成果表明腫瘤細胞懸液的制備方法也會影響裸鼠移植瘤模型的建立，本實驗組圍繞這一設想展開了一系列深入的研究。

PBS 緩沖液和無血清的DMEM 溶液是目前國內(nèi)外制造肝癌移植瘤模型時常用來稀釋肝癌細胞制懸的液體［5，7］，含10%血清的DMEM 溶液是肝癌細胞體外培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。因而本研究選用以上3 種液體稀釋肝癌細胞制懸后建立肝癌裸鼠移植瘤模型(皮下瘤及原位瘤)并進行比較。結果發(fā)現(xiàn):制造肝癌裸鼠皮下瘤模型時雖然腫瘤的生長過程(體積、瘤重)和選用的肝癌細胞制懸液體無關;但是，相比含10%血清的DMEM 溶液，選用PBS 緩沖液或者無血清的DMEM 對肝癌細胞進行稀釋制懸能明顯提高造模的成功率。制造肝癌裸鼠原位瘤模型時，相比無血清的DMEM 溶液或含血清的DMEM 溶液，選用PBS 緩沖液對肝癌細胞進行稀釋制懸具有更高的造模成功率。

裸鼠皮下移植瘤模型是研究人類腫瘤生物特性及腫瘤治療常用的實驗模型。這種模型可以保持原發(fā)腫瘤本身所具有的形態(tài)特征和遺傳性，已成為體內(nèi)研究惡性腫瘤生物學特性和篩選抗癌藥物的理想工具［10］。本實驗組通過建立肝癌裸鼠皮下瘤模型發(fā)現(xiàn):制造肝癌裸鼠皮下瘤模型時雖然腫瘤的生長過程(體積、瘤重)和選用的肝癌細胞制懸液體無關;但是，相比含10%血清的DMEM 溶液，選用PBS 緩沖液或者無血清的DMEM 對肝癌細胞進行稀釋制懸能明顯提高造模的成功率。含血清的DMEM 溶液相比其余兩種液體最大的區(qū)別在于血清，血清在動物細胞培養(yǎng)中起著多方面的作用，但是也存在一些弊端，比如血清成分不明確，存在不少有害成分，比如補體、免疫球蛋白和一些生長抑制因子等;并且不同動物、不同批次的血清成分和活性也有很大不同［11-12］;另一方面，不同的血清對細胞的損傷效應與血清供體和靶細胞的親緣關系有關，它們之間的親緣關系越遠，損傷效應的活性越高，同種血清則沒有明顯的作用［13］，以上原因可能導致含血清的DMEM 溶液不適宜用來稀釋肝癌細胞制懸而建立裸鼠移植瘤模型，但是關于為什么不影響皮下瘤生長過程的原因有待于進一步的探究。

原位移植瘤模型能較好的模擬腫瘤細胞在人體內(nèi)生長的微環(huán)境，具有較快的生長速度、較強的侵襲和遠處轉移能力，是目前研究腫瘤侵襲轉移的最佳模型。本實驗組通過建立肝癌裸鼠原位瘤模型發(fā)現(xiàn):制造此模型時，相比無血清的DMEM 溶液或含血清的DMEM溶液，選用PBS 緩沖液對肝癌細胞進行稀釋制懸具有更高的造模成功率。比較3 種用來制懸的液體，除了上述血清方面的原因值得我們關注外，另一方面，DMEM 溶液相比PBS 緩沖液雖然在無機鹽成分、pH等方面無明顯區(qū)別，但是前者含有大量的高糖及氨基酸成分，肝臟是體內(nèi)最主要的葡萄糖及氨基酸代謝場所，大量的高糖與氨基酸直接進入肝臟將影響許多與代謝相關的基因［14］，并且，糖與氨基酸超過肝臟的耐受能力也會在一定程度上損傷肝臟細胞，所以，這可能是DMEM 溶液不適宜用來稀釋肝癌細胞制懸而建立肝癌裸鼠原位瘤模型的原因之一，但是更多的可能原因與具體機制還有待于進一步研究與探討。

總之，本實驗組通過選用不同液體對肝癌細胞制懸后建立肝癌裸鼠移植瘤模型，優(yōu)選造模方法，為肝癌的研究和治療奠定了一定的基礎。

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