miR-29 對(duì)胃腺癌細(xì)胞侵襲力的影響

陳五一，黃 蓋，田邦妮，陳愛華

1.湖北省恩施州來鳳縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 恩施445700;2.湖北省武漢市華潤(rùn)武鋼醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌是消化道常見惡性腫瘤，在全世界發(fā)病率均較高，多數(shù)患者發(fā)病后均在中晚期發(fā)現(xiàn)，因而患者5 年生存率較低［1-2］。對(duì)于胃癌的治療以手術(shù)為主，但是無論是早期還是中晚期胃癌均存在術(shù)后復(fù)發(fā)情況。MicroRNA 是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的單鏈小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)多種mRNA 對(duì)于腫瘤的發(fā)生及發(fā)展均有參與［3］，miR-29 為近年來新發(fā)現(xiàn)的可能與腫瘤發(fā)生與發(fā)展有關(guān)的miRNA 分子，其在胃癌患者局部組織中表達(dá)存在下調(diào)情況，因而可能與胃癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。本文旨在探討miR-29 對(duì)胃腺癌細(xì)胞侵襲力的影響，以期為胃癌的轉(zhuǎn)移侵襲機(jī)制提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集來鳳縣人民醫(yī)院2012 年1 月-2012 年12 月外科住院治療的胃腺癌患者胃癌標(biāo)本46份及胃癌旁標(biāo)本46 份。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)患者術(shù)后病理檢查證實(shí)為胃腺癌，為進(jìn)展期胃癌;(2)均為首次確診及首次治療;(3)均行胃癌根治術(shù);(4)術(shù)前未進(jìn)行任何化療及放療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者病理檢查不詳，或非胃腺癌，分化程度不詳;(2)同時(shí)合并其他惡性腫瘤者;(3)術(shù)前接受過其他治療者;(4)病歷資料不完整者。合格標(biāo)本中，男24 例，女22 例，年齡39 ～68 歲，中位年齡56.38 歲，胃癌分期采用TNM 分期法，Ⅰ～Ⅱ期20 例，Ⅲ～Ⅳ期26 例。

1.2 試劑及儀器 所用熒光定量PCR 試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本TaKaRa 公司生產(chǎn)，miR-29mimics 對(duì)照品及PCR 引物為廣州銳博生物科技有限公司生產(chǎn)，熒光定量PCR 檢測(cè)儀器為美國(guó)AB 公司生產(chǎn)的ABI7500 PCR 檢測(cè)儀。

1.3 方法

1.3.1 RNA 提取:取胃癌標(biāo)本10 mg 加入Trizol 試劑，再加入2 ml 液氮，根據(jù)操作說明書提取RNA，測(cè)定RNA 濃度。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng):取RNA 為模板，根據(jù)RT 逆轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)反應(yīng)，以U6 管家為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本3 個(gè)復(fù)孔，在95 ℃5 s、60℃30 s 擴(kuò)增循環(huán)40 個(gè)周期。采用2-△△CT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，△CT = 目的基因值- 內(nèi)參照基因CT 值，△△CT=待測(cè)標(biāo)本的△CT-矯正器△CT［4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用x±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織標(biāo)本中miR-29 的表達(dá)水平PCR 反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果顯示胃癌組織中miR-29a、miR-29b、miR-29c 相對(duì)含量分別為14.13 ±5.78、9.81 ±1.95、16. 77 ± 2. 04，癌旁組織中分別為31. 64 ±10.26、26.88 ±5.03、52.57 ±8.02，胃癌組織中miR-29的相對(duì)含量明顯低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.09、21.46、29.34，P 均＜0.05)。

2.2 胃癌與癌旁組織標(biāo)本中miR-29 的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 將胃癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本中的miR-29 相對(duì)含量計(jì)算比值(C/P)，將患者的不同臨床病理特征下C/P 比值進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示患者不同性別、年齡、TNM 分期、腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、分化程度時(shí)C/P 值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，miR-29a C/P 值明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)(P ＜0.05)，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)miR-29b、miR-29c C/P 值明顯低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)(P ＜0.05，見表1)。

表1 胃癌與癌旁組織標(biāo)本中miR-29 的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系(x±s)Tab 1 Relationship between gastric cancer and tissue adjacent to carcinoma specimens in miR-29 relative content (C/P)and the clinical pathological features (x±s)

3 討論

miRNA 是內(nèi)源性編碼的小RNAs，研究發(fā)現(xiàn)其能參與腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯等環(huán)節(jié)［3］，因而與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲過程關(guān)系密切。通過臨床的相關(guān)研究文獻(xiàn)報(bào)道可以看出miRNA 在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)存在差異［3，5-6］，因而在腫瘤的診斷及治療過程中miRNA 的表達(dá)也幫助臨床醫(yī)師判斷病情的發(fā)展及預(yù)后，而且還可將miRNA 作為腫瘤的干預(yù)治療靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。

miRNA 的具體功能尚未研究清楚，研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在多種惡性腫瘤中均能起到抑癌基因的作用，如Zhao 等［7］研究發(fā)現(xiàn)miRNA 能使實(shí)體腫瘤的T 細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞免疫功能下降，在實(shí)體腫瘤中表達(dá)下調(diào)，在外套細(xì)胞淋巴瘤患者中miRNA 表達(dá)顯著下調(diào)的患者較miRNA 表達(dá)正常的患者預(yù)后更差，認(rèn)為可能是通過調(diào)節(jié)p53、CDK6 等靶基因從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。胃癌也為實(shí)體瘤，何兵等［8］通過基因芯片檢測(cè)技術(shù)研究了miRNA 在胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制，結(jié)果顯示在胃癌患者癌組織中miRNA 較癌旁組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，提示miRNA 可能為抑癌基因，而且在不同臨床病理特征的情況下分析患者miRNA表達(dá)，顯示miRNA 與腫瘤的轉(zhuǎn)移也存在密切相關(guān)性，通過體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-29 慢病毒后胃癌細(xì)胞的體外侵襲能力減弱，提示可能是通過ITCB1 抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲。陳陵等［9］研究發(fā)現(xiàn)miR-29 在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，其與微血管密度水平呈負(fù)相關(guān)，微血管密度生成是引起腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的最重要條件之一，因而miR-29 還可能通過抑制微血管生成而抑制腫瘤的發(fā)展。李學(xué)成等［10］研究結(jié)果也顯示胃癌組織中的miR-29 高表達(dá)的患者其胃癌組織中的血管內(nèi)皮因子-A 表達(dá)較低，也提示了miR-29 可能為潛在的抑癌基因。本研究結(jié)果顯示胃腺癌組織中miR-29 表達(dá)相對(duì)含量明顯低于癌旁組織，這也與前面研究結(jié)果一致，胃癌組織標(biāo)本與癌旁組織標(biāo)本中的miR-29 相對(duì)含量比值(C/P)在患者不同性別、年齡、TNM 分期、浸潤(rùn)深度、分化程度時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)miR-29a C/P 值明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)miR-29b、miR-29c C/P 值明顯低于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，提示miR-29 的表達(dá)與胃腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，不同的亞型所起的作用可能有所不同，具體機(jī)制尚需更多臨床研究去證實(shí)。

綜上所述，胃腺癌組織中miR-29 表達(dá)明顯低于癌旁組織，miR-29a 在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-29b、miR-29c在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者胃腺癌組織中表達(dá)降低，提示其可能與胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

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