家禽卵泡閉鎖研究進(jìn)展

張昊　陳芳　梁振華　杜金平

摘要：家禽卵泡閉鎖是繁殖過程中重要生理現(xiàn)象，也是一種多因素調(diào)控的選擇性細(xì)胞凋亡過程。研究卵泡的閉鎖可以為家禽繁殖性能提高提供理論依據(jù)。對家禽的卵泡顆粒細(xì)胞凋亡與卵泡閉鎖、激素對顆粒細(xì)胞凋亡的影響、顆粒細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因、生長因子、細(xì)胞因子和miRNAs等方面進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：家禽；卵泡閉鎖；進(jìn)展

中圖分類號：S814.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2014）10-0061-05

卵泡閉鎖是卵泡從發(fā)育到排卵前所發(fā)生的退化并最終被清除的生理現(xiàn)象。哺乳動物和鳥類中，卵泡閉鎖是一種正常的繁殖生理過程。在家禽中，卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的任何時期都會發(fā)生，而閉鎖卵泡的數(shù)量直接影響到產(chǎn)蛋率的高低。閉鎖卵泡數(shù)少的個體進(jìn)入等級卵泡的數(shù)量增多，產(chǎn)蛋序列延長，產(chǎn)蛋率增加。卵泡閉鎖的潛在機(jī)理是卵泡中發(fā)生了細(xì)胞凋亡，其中卵泡顆粒細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致卵泡閉鎖的根本原因。而卵泡顆粒細(xì)胞凋亡是多因素參與的復(fù)雜調(diào)控過程，激素、細(xì)胞因子等可通過抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對該進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控。有關(guān)禽類卵泡閉鎖的研究遠(yuǎn)不及哺乳動物深入，但哺乳動物卵泡閉鎖發(fā)生機(jī)制的研究有助于探討禽類卵泡閉鎖的機(jī)理。而禽類卵泡閉鎖的研究對提高家禽繁殖能力有重要的指導(dǎo)意義。

1 卵泡顆粒細(xì)胞凋亡與卵泡閉鎖

禽類的卵泡閉鎖在卵泡發(fā)育的各個時期都有發(fā)生，并具有明顯的形態(tài)特征：表現(xiàn)為卵泡表面出現(xiàn)出血點(diǎn)，卵泡塌陷變形。Gupta等[1]通過組織學(xué)方法對雞部分卵泡觀察研究發(fā)現(xiàn)，卵泡閉鎖主要表現(xiàn)為兩種形式：一種是直徑小于1mm卵泡的非破裂型閉鎖，表現(xiàn)為閉鎖卵泡內(nèi)容物吸收，膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞分離；另一種則是直徑大于1 mm的破裂型閉鎖，表現(xiàn)為細(xì)小、不可見的卵泡壁的破裂，蛋黃液和各種細(xì)胞通過破裂處進(jìn)入間質(zhì)。同時發(fā)現(xiàn)，破裂型閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)顯著低于正常細(xì)胞。

在哺乳動物中，有學(xué)者指出，羊卵泡內(nèi)膜細(xì)胞在卵泡閉鎖過程中發(fā)生核固縮、核破裂，然后進(jìn)入卵泡液，最終被巨噬細(xì)胞吞噬。Zeleznik等采用生化手段研究大鼠的顆粒細(xì)胞和黃體，首次指出卵巢內(nèi)表現(xiàn)出凋亡特有的DNA階梯。后來，越來越多的研究表明，在哺乳動物中，細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的根本原因，顆粒細(xì)胞凋亡觸發(fā)了卵泡閉鎖[2]。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是生物機(jī)體維持自身穩(wěn)定的一種基本生理機(jī)制，是機(jī)體生長、分化、發(fā)育以及病理過程中由基因編碼決定的生理性、主動性細(xì)胞死亡， 具有特定的時空順序和形態(tài)學(xué)特征。卵泡閉鎖的早期特征是顆粒細(xì)胞核固縮，最終導(dǎo)致卵泡坍塌，基膜不完整，顆粒細(xì)胞數(shù)減少。

在家禽中，Tilly等[3]發(fā)現(xiàn)雞的卵泡閉鎖過程中存在顆粒細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。而在正常的生長卵泡內(nèi)，顆粒細(xì)胞分裂增殖和凋亡現(xiàn)象是并存的[4]，當(dāng)發(fā)育卵泡中凋亡的顆粒細(xì)胞比率達(dá)到10%以上，發(fā)生卵泡閉鎖[5]。Johnson等[6]證實雞卵巢的卵泡閉鎖起始于顆粒細(xì)胞層，并受到細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)。鵝閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞也表現(xiàn)出明顯的凋亡特征[7]。禽類卵泡閉鎖主要與卵泡發(fā)育程度[8]、卵泡在卵巢中的部位以及家禽品種有關(guān)。

2 激素對顆粒細(xì)胞凋亡的影響

對哺乳動物卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生殖激素在這一過程中發(fā)揮了不可忽視的作用。研究認(rèn)為，促卵泡生成素（FSH）是調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡的主要調(diào)控激素，其他激素通過影響FSH分泌間接發(fā)揮作用因此，下面主要從激素對卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行闡述。

2.1 FSH對卵泡顆粒細(xì)胞的影響

促卵泡生成素（FSH）又稱卵泡刺激素，由腦垂體分泌。FSH的主要作用位點(diǎn)為成熟卵泡和小卵泡的膜細(xì)胞，可調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，誘導(dǎo)黃體生產(chǎn)素受體的形成，刺激類固醇激素合成等。FSH通過與膜受體FSHR結(jié)合，從而激活相關(guān)的信號通路，如PKA、PI3K/Akt、ERK1/2、ERK5、p38 MAPK以及VEGF等發(fā)揮其生理作用[9]。其對卵泡的作用主要表現(xiàn)為：使卵巢血液循環(huán)加快并增強(qiáng)卵泡壁細(xì)胞的攝氧量，促進(jìn)卵黃沉積，最終使卵泡的重量和體積增加。研究發(fā)現(xiàn)，摘除垂體的產(chǎn)蛋雞，大中型卵泡萎縮，通過注射FSH可使卵泡繼續(xù)生長[10]。對體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH誘導(dǎo)6～8 mm的卵泡顆粒細(xì)胞芳香化酶活性，促進(jìn)孕酮的合成，并促進(jìn)顆粒細(xì)胞分化。由于FSH通過其受體（FSHR）發(fā)揮作用，雞FSHR在產(chǎn)蛋期卵巢的不同等級卵泡內(nèi)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都有表達(dá)，等級卵泡顆粒細(xì)胞上FSHR數(shù)目隨卵泡成熟下調(diào)。康麗等[11]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因5調(diào)控區(qū)的多態(tài)位點(diǎn)可以通過調(diào)節(jié)FSHR的mRNA表達(dá)量，且FSHR表達(dá)與開產(chǎn)日齡正相關(guān)。由此可見，F(xiàn)SH與其受體在禽類卵泡發(fā)育中的作用是抑制顆粒細(xì)胞凋亡，防止卵泡閉鎖，促進(jìn)卵泡發(fā)育[12]。

2.2 促性腺激素釋放激素（GnRH）對顆粒細(xì)胞凋亡的影響

GnRH通過下丘腦-垂體-性腺軸起作用，能夠促進(jìn)垂體前葉釋放FSH和促黃體素（LH），故GnRH也具有與FSH相同的抑制顆粒細(xì)胞凋亡的作用。活體試驗也表明，在生產(chǎn)中使用GnRH類似物能夠增加產(chǎn)蛋量。說明GnRH對卵泡發(fā)育和排卵起促進(jìn)作用。近年來，許多研究者將研究重點(diǎn)集中于GnRH的直接作用。GnRH具有其直接結(jié)合受體（GnRHR），在卵巢內(nèi)膜的顆粒細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞中都存在GnRHR表達(dá)。張海峰等[13]研究表明，GnRH單獨(dú)處理能夠促進(jìn)離體培養(yǎng)的雞卵泡顆粒細(xì)胞分泌孕酮。

綜上所述，GnRH對卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡起抑制作用，主要通過兩種方式：一種是通過刺激FSH分泌，另一種是直接作用于卵泡顆粒細(xì)胞，通過其受體發(fā)揮作用。但是兩種方式之間如何協(xié)調(diào)，GnRH與其受體結(jié)合后通過何種信號通路抑制顆粒細(xì)胞凋亡，不同濃度下GnRH的不同作用等，均有待于進(jìn)一步的研究。

2.3 催乳素（PRL）對卵泡顆粒細(xì)胞的影響

催乳素是一種具有多種生理功能的激素，能夠促使禽類就巢。PRL作用于卵巢能夠抑制卵泡生長。對禽類研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)禽類就巢時，其卵泡發(fā)育停止，卵泡萎縮，血液中PRL濃度升高。對產(chǎn)蛋期母雞注射外源PRL，也會產(chǎn)生就巢行為，卵巢中卵泡發(fā)生萎縮。然而，F(xiàn)SH與PRL同時處理的產(chǎn)蛋期母雞不發(fā)生卵泡萎縮現(xiàn)象?；铙w試驗發(fā)現(xiàn)，高水平PRL通過抑制GnRH的分泌降低FSH和LH的分泌，從而抑制鳥類卵泡發(fā)育[14， 15]。因此，推斷PRL通過調(diào)控下丘腦-垂體-性腺軸引起卵泡萎縮[16]。RRL對靶組織發(fā)揮生理作用途徑之一是通過與其受體（PRLR）結(jié)合，而卵泡的內(nèi)膜細(xì)胞具有PRLR。在體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中的研究結(jié)果顯示，PRL能夠抑制膜細(xì)胞合成睪酮和雌二醇。由此可見，PRL還能夠通過作用于卵泡膜，抑制類固醇激素合成，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。但PRL對卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的具體發(fā)生機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。

2.4 類固醇激素對卵泡顆粒細(xì)胞的影響

與禽類卵泡生長凋亡相關(guān)的類固醇激素主要包括兩種，一種是源于卵泡內(nèi)膜細(xì)胞的雌激素，主要為雌二醇（E2），另一種是卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的孕激素，主要為孕酮（P4），這兩種激素都是甾醇類激素，是甾體化合物通過一系列酶促反應(yīng)形成。

雌激素具有促進(jìn)卵泡生長的作用，能夠抑制顆粒細(xì)胞凋亡。在卵巢中，雌激素主要由大中型卵泡分泌，因此，在高產(chǎn)家禽中，雌激素含量相對較高，而在休產(chǎn)期和就巢期E2的水平顯著低于產(chǎn)蛋期[17]。陳秀萍等[7]研究發(fā)現(xiàn)，鵝閉鎖卵泡卵黃的雌激素水平極顯著低于正常卵泡。雌激素主要通過結(jié)合其受體后經(jīng)特定的細(xì)胞信號通路發(fā)揮其生理作用。雌激素的受體有多種亞型，包括經(jīng)典的雌激素受體α（ERα）和雌激素受體β（ERβ）以及膜性受體等。關(guān)于雌激素通過其受體發(fā)揮生理作用的研究主要在哺乳動物上，且主要集中于表達(dá)定位。在生殖系統(tǒng)中，ERα主要存在于卵囊泡膜細(xì)胞中，ERβ主要存在于卵泡顆粒細(xì)胞[18]。由于雌激素與其受體主要通過ERα/ERβ同二聚體或ERα/ERβ異二聚體結(jié)合，故靶器官中ERα、ERβ的比例也是激素發(fā)揮作用的重要因素。目前，具體的作用機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。

禽類卵巢中無黃體，因此孕酮主要由卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生。哺乳動物中研究發(fā)現(xiàn)，孕酮拮抗劑可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，刺激卵泡閉鎖，說明孕酮具有抑制卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的作用。而大劑量的孕酮抑制FSH和LH的分泌，對卵泡發(fā)育起抑制作用，說明孕激素發(fā)揮作用具有濃度依賴性。隨著孕酮的相應(yīng)核受體（PGR）的發(fā)現(xiàn)，孕激素對卵泡閉鎖的研究將進(jìn)一步深入。

3 顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、生長因子和細(xì)胞因子的研究進(jìn)展

3.1 影響顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的相關(guān)基因

抑癌基因P53蛋白定位于閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞核上，可以抑制細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。在閉鎖卵泡中，P53的mRNA表達(dá)顯著增加。FSH可以通過影響體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞中P53蛋白的表達(dá)，減少顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生。

WT-1抑癌基因mRNA在小鼠卵泡顆粒細(xì)胞 中高表達(dá)。FSH抑制顆粒細(xì)胞凋亡時，WT-1基因3種亞型的mRNA表達(dá)量均下降。在鳥類和哺乳動物中，WT-1主要在未成熟的卵泡中表達(dá)。WT-1可能參與調(diào)控卵泡的成熟，阻止卵泡體細(xì)胞過早分化[19]。有報道認(rèn)為WT-1可能通過抑制生長因子的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）基因家族，其作用不是促進(jìn)細(xì)胞增殖，而是通過阻斷程序性細(xì)胞死亡信號通路中的最終共同通道而延長細(xì)胞生命期，是一種重要的細(xì)胞存活基因[20]。卵泡自噬體的積累會增加顆粒細(xì)胞的凋亡，而該過程主要是通過降低Bcl-2的表達(dá)水平實現(xiàn)的[21]。敲除Bcl-2小鼠，初級卵泡減少；而Bcl-2過表達(dá)則導(dǎo)致出生后小鼠體內(nèi)卵泡數(shù)增加，該結(jié)果說明Bcl-2具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞存活作用[22]。雞的4～8 mm卵泡顆粒細(xì)胞易發(fā)生凋亡引起卵泡閉鎖，此時期的顆粒細(xì)胞中檢測不到Bcl-2家族蛋白表達(dá)產(chǎn)物，而F1卵泡中顆粒細(xì)胞的Bcl-2家族蛋白產(chǎn)物最多[23]。

Fas/FasL系統(tǒng)是腫瘤壞死因子（TNF）和神經(jīng)生長因子受體（NGF-R）家族的細(xì)胞表面分子，具有3個與細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)域。Fas是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞膜表面蛋白，存在于顆粒細(xì)胞和黃體細(xì)胞中。以此蛋白為抗原的配體FasL在顆粒細(xì)胞核有活性的T細(xì)胞中存在。Fas抗體或FasL通過與Fas結(jié)合來導(dǎo)致攜帶Fas的細(xì)胞凋亡[24]。研究發(fā)現(xiàn)大鼠閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞中Fas的mRNA表達(dá)，而健康的顆粒細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)Fas抗原，說明該系統(tǒng)發(fā)生在閉鎖的卵泡中。Fas調(diào)節(jié)小鼠顆粒細(xì)胞凋亡的功能可以被生長因子抑制，也可以受到一些細(xì)胞因子活化。

3.2 影響顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的生長因子

多種生長因子能夠調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖。EGF、TGF-α可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖， 抑制其凋亡。EGF可促進(jìn)有絲分裂活性和顆粒細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)類固醇激素的合成。EGF與TGF-α具有同源結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞中，EGF和TGF-α的添加可以抑制顆粒細(xì)胞的自發(fā)凋亡[25]。胰島素生長因子（IGFs）是一種多能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在哺乳動物卵巢的顆粒細(xì)胞區(qū)，IGF- I 與其受體結(jié)合，可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，并維持芳香化酶功能，使雌激素合成增加，促進(jìn)卵泡進(jìn)一步發(fā)育。卵泡體外培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，IGF-I 能顯著提高產(chǎn)蛋雞 SYF 顆粒層和膜層的細(xì)胞數(shù)目以及厚度[26]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）能夠促進(jìn)有絲分裂，顆粒細(xì)胞可以分泌bFGF，通過旁分泌途徑影響卵泡內(nèi)膜血管的發(fā)生，促進(jìn)卵泡生長。生長分化因子-9（GDF-9）通過抑制顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖，對卵母細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用，并能影響類固醇激素的合成，抑制FSH誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞黃體化。GDF-9敲除的卵母細(xì)胞，卵泡不能發(fā)育到次級卵泡階段[27]。

3.3 影響顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖的細(xì)胞因子

細(xì)胞因子能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能，是一類具有廣泛生物活性的激素樣多肽。其中，白血病抑制因子（LIF）能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)原始卵泡的發(fā)育。干細(xì)胞生長因子（SCF）具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的作用，顆粒細(xì)胞可以合成SCF。SCF在顆粒細(xì)胞與內(nèi)膜細(xì)胞互作中發(fā)揮重要作用，并能促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育。

4 與卵泡閉鎖相關(guān)miRNA的研究

miRNA是一類長度為18-25核苷酸，對靶基因mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA。到目前為止，已有許多研究證實miRNA參與凋亡調(diào)控。Yamakuchi等[28]研究結(jié)果證實，miR-34a可以通過靶向p53的去乙酰化酶SIRT1基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-15和miR-16可通過靶向調(diào)節(jié)抗凋亡基因Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29， 30]。miR-29可以通過靶向Bcl-2家族成員Mcl-1基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡[31]。除此之外，miR-23a也被證實可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡[32]。與這些miRNAs作用相反，miR-21、miR-17-5p以及miR-20a等具有抗凋亡作用[33， 34]。在小鼠卵泡發(fā)育過程中，miR-383和miR-320可通過不同的靶基因?qū)︻w粒細(xì)胞的增殖和激素分泌進(jìn)行調(diào)控[35]。林飛[36]檢測了豬卵泡閉鎖過程中的miRNAs，在卵泡閉鎖過程中鑒定出近200種差異表達(dá)的miRNAs，并認(rèn)為let-7a、miR-26b等可能在細(xì)胞凋亡通路中起調(diào)控作用。劉吉英[37]的研究結(jié)果也證實，miR-26b可靶向Smad4調(diào)控豬卵泡顆粒細(xì)胞凋亡。但到目前為止關(guān)于miRNA在家禽卵泡閉鎖中的研究還較少。

5 營養(yǎng)因素對家禽卵泡閉鎖的影響

劉立文等[38]試驗發(fā)現(xiàn)，低能量日糧組和高能量日糧組飼喂的柴雞卵巢中，F(xiàn)SHR和LHR的mRNA表達(dá)水平呈極顯著差異，并認(rèn)為日糧能量可通過下丘腦-垂體-性腺軸對其生殖機(jī)能產(chǎn)生影響。張弘馨等研究發(fā)現(xiàn)，體外無血清培養(yǎng)的種母雞顆粒細(xì)胞中，維生素E的添加可以降低顆粒細(xì)胞的凋亡率[39]。研究飼糧中不同營養(yǎng)成分對家禽卵泡閉鎖的影響，對提高家禽產(chǎn)蛋性能具有重要的指導(dǎo)意義。

6 家禽卵泡閉鎖的意義

家禽產(chǎn)蛋期卵巢中有大小不等的卵泡，以及等級排列的成熟卵泡。卵泡的閉鎖是家禽繁殖過程中的重要生理現(xiàn)象，能夠清除受損和減數(shù)分裂異常的細(xì)胞，有效防止機(jī)體對非優(yōu)勢卵泡營養(yǎng)和能量的供給，對保證優(yōu)勢卵泡發(fā)育具有重要意義。外界環(huán)境改變、優(yōu)勢卵泡選擇、不同品種家禽的產(chǎn)蛋習(xí)慣等都會影響卵泡閉鎖。家禽卵泡閉鎖的調(diào)節(jié)機(jī)制作為一個多種因素參與的復(fù)雜過程，至今尚須深入的研究探討。

研究家禽卵泡閉鎖的機(jī)制，將有助于家禽繁殖性能提高。為在養(yǎng)殖生產(chǎn)中通過育種手段進(jìn)行低產(chǎn)基因篩選，及促繁殖添加劑的開發(fā)提供更有力的理論依據(jù)。

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