規(guī)?；鲋虏⌒源竽c桿菌的分離與鑒定

楊克禮+李傳友+郭銳+段正贏+田永祥

摘要：湖北省某肉牛場2014年3～4月發(fā)生牛腹瀉，無菌采集病牛腹瀉物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，涂片、染色、鏡檢觀察，并對其形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性及致病性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明引起該次疫病的病原是致病性大腸桿菌（E. coli）。

關(guān)鍵詞：牛；致病性大腸桿菌（E. coli）；分離；鑒定

中圖分類號：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）10-0005-02

大腸埃希氏菌（E. coli）通常稱為大腸桿菌，由Escherich于1885年首次在動(dòng)物的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)[1]。在大腸桿菌中，大多數(shù)是不致病的腸道常在菌，少數(shù)具有致病性。大腸桿菌病又稱大腸桿菌性腹瀉，是由致病性大腸桿菌引起的一種急性傳染病。自從1894年大腸桿菌病首次在瑞典、荷蘭、法國等養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)國家暴發(fā)以來，給世界畜牧業(yè)造成了巨大損失[2]。該病的主要特征為敗血癥和嚴(yán)重腹瀉、脫水，引起幼畜大量死亡或發(fā)育不良。隨著我國畜牧業(yè)規(guī)?；?、集約化飼養(yǎng)模式的發(fā)展，該病的發(fā)病率和死亡率逐年增加。

2014年3～4月間，湖北省某規(guī)?；馀霭l(fā)生了以高熱，食欲廢絕，排水樣、糊狀或褐色糞便，少數(shù)排血樣糞便，最終消瘦乃至死亡等癥狀的傳染性疾病，全場發(fā)病率達(dá)30%，犢牛發(fā)病率高達(dá)76%，死亡率達(dá)5%。

為了弄清本次發(fā)病的主要病因，無菌采集病牛腹瀉物，從中分離出致病性大腸桿菌，并對分離獲得的菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性研究。

1 材料與方法

1.1 病料

病牛腹瀉物。無菌采集，采樣人帶一次性無菌手套直腸采集，保證一頭牛一個(gè)手套，防止交叉污染。

1.2 培養(yǎng)基的制備

1.2.1 普通瓊脂培養(yǎng)基 量取牛肉湯500 mL，加入5 g蛋白胨、2.5 g氯化鈉，放蒸汽鍋內(nèi)加溫30 min，調(diào)整pH為7.2～7.4，再置蒸汽鍋內(nèi)加熱30 min，用濾紙過濾。加入15 g的瓊脂，置蒸汽鍋內(nèi)加熱至完全溶解。分裝于錐形瓶中，置高壓蒸汽鍋內(nèi)， 121 ℃滅菌20 min。待冷卻至50 ℃左右時(shí)倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，完全冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血液瓊脂培養(yǎng)基 取上述經(jīng)滅菌后的普通瓊脂冷至50 ℃左右的普通瓊脂100 mL，無菌加入家兔脫纖維血液15 mL，混勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，完全冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基 取上述經(jīng)滅菌后的普通瓊脂100 mL溶解滅菌，并冷卻至60 ℃左右，分別加入滅菌的20%乳糖溶液2 mL、2%伊紅水溶液2 mL及5%美藍(lán)水溶液1 mL，混勻后傾入滅菌平皿中，完全冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 SS瓊脂 牛肉膏2.5 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂9 g加入500 mL蒸餾水中，加熱溶解。再加入膽鹽4 g、乳糖5 g、枸櫞酸鈉6 g、硫代硫酸鈉6 g及枸櫞酸鐵0.25 g，微熱加溫使其全部溶解，調(diào)整pH為7.2?；靹蚝髢A入滅菌平皿中，完全冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 麥康凱培養(yǎng)基 取蛋白胨2.0 g、氯化鈉0.5 g、乳糖1.0 g、膽鹽0.5 g和100 mL蒸餾水，調(diào)整pH為7.4，加入2.5g瓊脂，分裝于錐形瓶中，121 ℃滅菌15 min，待冷至50 ℃左右時(shí)，加入滅菌的1%中性紅水溶液0.5 mL，搖勻后傾入培養(yǎng)皿，完全冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6三糖鐵培養(yǎng)基 取適量三糖鐵瓊脂粉，加入100 mL蒸餾水，加熱溶解，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，待冷至50 ℃左右時(shí)分裝試管，使成底層較深的斜面。

1.3 試劑

微量生化鑒定管為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品，購自武漢市某商業(yè)公司。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

8～10 g SPF昆明鼠，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.5 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定

采用需氧和厭氧（缸內(nèi)燃燭法）兩種方法，利用普通瓊脂培養(yǎng)基從病料中分離細(xì)菌。對不同形態(tài)的菌落進(jìn)行涂片、染色、鏡檢和純培養(yǎng)。將純培養(yǎng)菌接種于5%血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌培養(yǎng)特性。

1.6 分離菌生化試驗(yàn)

取生長良好的紅色菌落接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng) 24 h，按常規(guī)方法進(jìn)行生化試驗(yàn)，主要包括葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖的發(fā)酵試驗(yàn)，硫化氫、丙二酸鹽利用、枸櫞酸鹽利用、鳥氨酸鹽脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、葡萄糖磷酸鹽、衛(wèi)茅醇試驗(yàn)等。

1.7 動(dòng)物試驗(yàn)

將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于普通肉湯中培養(yǎng)24h，分別以口腔和腹腔途徑各接種5只SPF昆明小鼠，每只接種0.2 mL（約含108 CFU/mL）菌液，另取2只作為對照，隔離飼養(yǎng)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的形態(tài)

自患牛腹瀉物中分離獲得純化菌株1株。該分離菌為兼性厭氧菌，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上就可以生長，顯微鏡下可以見到菌體短小，兩端鈍圓、著色較深， 無芽孢，多呈單個(gè)排列， 個(gè)別形成短鏈狀排列，革蘭氏染色陰性（圖1）。

2.2 分離菌培養(yǎng)特性

分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，為中等大小、邊緣整齊、光滑濕潤、有圓形隆起的菌落。最適生長溫度為 37 ℃，最適生長 pH 為 7.2～7.4。分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑的紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色，具有金屬光澤的小菌落；在 ss 瓊脂培養(yǎng)基上一般不生長或生長較差，菌落明顯比前兩種的?。辉谌氰F瓊脂斜面培養(yǎng)基上形成黃色斜面，黃色底層并有少量氣泡產(chǎn)生；在血液瓊脂培養(yǎng)基上 37 ℃培養(yǎng) 24 h 后可以形成灰色菌落，菌落表面光滑、邊緣整齊，菌落周圍有明顯的 α、β溶血環(huán)。

2.3 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的生理生化特性見表1。分離菌株分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不發(fā)酵蔗糖、衛(wèi)茅醇，液化明膠，葡萄糖磷酸、硫化氫、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽試驗(yàn)陰性；鳥氨酸鹽脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陽性。

注：“+”表示為陽性；“-”表示為陰性。

2.4動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

兩種途徑接種的小鼠在 24～48 h 內(nèi)均死亡，而對照組的小鼠則全部健活，并且從死亡小鼠的肝組織中分離到接種菌。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)臨床癥狀結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，可以確診該牛廠發(fā)生的牛腹瀉是由致病性性大腸桿菌引起的。

在大腸桿菌的致病過程中，纖毛抗原和腸毒素是兩種主要的致病因子[3，4]。腸致病性大腸桿菌首先是利用纖毛抗原粘著于小腸黏膜的上皮細(xì)胞上，然后大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。消化道途徑是致病性大腸桿菌侵入機(jī)體的主要途徑，它通過菌體表面的一種對宿主特異性的粘附因子粘附到宿主小腸黏膜表面并繁殖，分泌腸毒素，引起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)的代謝紊亂，導(dǎo)致腹瀉[5]。

本次疫病的發(fā)生主要是受外界不良因素的刺激。由于畜舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件較差，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體抵抗力降低，再加上致病菌的大量繁殖，造成動(dòng)物發(fā)病。為降低該病的發(fā)生，在今后的飼養(yǎng)管理過程中，應(yīng)注意環(huán)境清潔，保持畜舍清潔干燥，及時(shí)清除糞便和污物，最好能夠每日用菌毒殺對牛欄消毒1次，同時(shí)合理搭配日糧，盡量減少應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力。

對于該病的預(yù)防，可以選擇與本場致病菌血清型一致的大腸桿菌苗或用本場致病菌株制備自家菌苗進(jìn)行免疫。發(fā)病時(shí)，通過藥敏試驗(yàn)篩選有效的抗菌藥物進(jìn)行治療。

本次分離獲得的致病性大腸桿菌是何種血清型及其藥物敏感性分析，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王德志.中藥抑制牛源致病性大腸桿菌對環(huán)丙沙星耐藥的研

究[D].黑龍江大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2009.

[2] 徐 兵. 濰坊地區(qū)肉雞大腸桿菌病的病原分離鑒定與防控研

究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 高 研，李衛(wèi)芬， 馬國霞. 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌主要致病因子及其致病機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊 ，2006（5）2-5.

[4] 崔玉東，劉桂清，樸范澤.育成牛大腸桿菌腸毒血癥病原分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1994，20（1）：9-10.

[5] 陳明勇，陳德成，賈君鎮(zhèn)，等.牦牛腸毒素型大腸桿菌的分離鑒定和某些生物學(xué)特性的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：277-279.

2.3 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的生理生化特性見表1。分離菌株分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不發(fā)酵蔗糖、衛(wèi)茅醇，液化明膠，葡萄糖磷酸、硫化氫、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽試驗(yàn)陰性；鳥氨酸鹽脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陽性。

注：“+”表示為陽性；“-”表示為陰性。

2.4動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

兩種途徑接種的小鼠在 24～48 h 內(nèi)均死亡，而對照組的小鼠則全部健活，并且從死亡小鼠的肝組織中分離到接種菌。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)臨床癥狀結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，可以確診該牛廠發(fā)生的牛腹瀉是由致病性性大腸桿菌引起的。

在大腸桿菌的致病過程中，纖毛抗原和腸毒素是兩種主要的致病因子[3，4]。腸致病性大腸桿菌首先是利用纖毛抗原粘著于小腸黏膜的上皮細(xì)胞上，然后大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。消化道途徑是致病性大腸桿菌侵入機(jī)體的主要途徑，它通過菌體表面的一種對宿主特異性的粘附因子粘附到宿主小腸黏膜表面并繁殖，分泌腸毒素，引起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)的代謝紊亂，導(dǎo)致腹瀉[5]。

本次疫病的發(fā)生主要是受外界不良因素的刺激。由于畜舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件較差，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體抵抗力降低，再加上致病菌的大量繁殖，造成動(dòng)物發(fā)病。為降低該病的發(fā)生，在今后的飼養(yǎng)管理過程中，應(yīng)注意環(huán)境清潔，保持畜舍清潔干燥，及時(shí)清除糞便和污物，最好能夠每日用菌毒殺對牛欄消毒1次，同時(shí)合理搭配日糧，盡量減少應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力。

對于該病的預(yù)防，可以選擇與本場致病菌血清型一致的大腸桿菌苗或用本場致病菌株制備自家菌苗進(jìn)行免疫。發(fā)病時(shí)，通過藥敏試驗(yàn)篩選有效的抗菌藥物進(jìn)行治療。

本次分離獲得的致病性大腸桿菌是何種血清型及其藥物敏感性分析，有待于進(jìn)一步研究。

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[1] 王德志.中藥抑制牛源致病性大腸桿菌對環(huán)丙沙星耐藥的研

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[2] 徐 兵. 濰坊地區(qū)肉雞大腸桿菌病的病原分離鑒定與防控研

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[4] 崔玉東，劉桂清，樸范澤.育成牛大腸桿菌腸毒血癥病原分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1994，20（1）：9-10.

[5] 陳明勇，陳德成，賈君鎮(zhèn)，等.牦牛腸毒素型大腸桿菌的分離鑒定和某些生物學(xué)特性的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：277-279.

2.3 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株的生理生化特性見表1。分離菌株分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，不發(fā)酵蔗糖、衛(wèi)茅醇，液化明膠，葡萄糖磷酸、硫化氫、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽試驗(yàn)陰性；鳥氨酸鹽脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸水解酶、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陽性。

注：“+”表示為陽性；“-”表示為陰性。

2.4動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

兩種途徑接種的小鼠在 24～48 h 內(nèi)均死亡，而對照組的小鼠則全部健活，并且從死亡小鼠的肝組織中分離到接種菌。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)臨床癥狀結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷，可以確診該牛廠發(fā)生的牛腹瀉是由致病性性大腸桿菌引起的。

在大腸桿菌的致病過程中，纖毛抗原和腸毒素是兩種主要的致病因子[3，4]。腸致病性大腸桿菌首先是利用纖毛抗原粘著于小腸黏膜的上皮細(xì)胞上，然后大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。消化道途徑是致病性大腸桿菌侵入機(jī)體的主要途徑，它通過菌體表面的一種對宿主特異性的粘附因子粘附到宿主小腸黏膜表面并繁殖，分泌腸毒素，引起腸黏膜細(xì)胞水與電解質(zhì)的代謝紊亂，導(dǎo)致腹瀉[5]。

本次疫病的發(fā)生主要是受外界不良因素的刺激。由于畜舍內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生條件較差，導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體抵抗力降低，再加上致病菌的大量繁殖，造成動(dòng)物發(fā)病。為降低該病的發(fā)生，在今后的飼養(yǎng)管理過程中，應(yīng)注意環(huán)境清潔，保持畜舍清潔干燥，及時(shí)清除糞便和污物，最好能夠每日用菌毒殺對牛欄消毒1次，同時(shí)合理搭配日糧，盡量減少應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗病力。

對于該病的預(yù)防，可以選擇與本場致病菌血清型一致的大腸桿菌苗或用本場致病菌株制備自家菌苗進(jìn)行免疫。發(fā)病時(shí)，通過藥敏試驗(yàn)篩選有效的抗菌藥物進(jìn)行治療。

本次分離獲得的致病性大腸桿菌是何種血清型及其藥物敏感性分析，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王德志.中藥抑制牛源致病性大腸桿菌對環(huán)丙沙星耐藥的研

究[D].黑龍江大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2009.

[2] 徐 兵. 濰坊地區(qū)肉雞大腸桿菌病的病原分離鑒定與防控研

究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[3] 高 研，李衛(wèi)芬， 馬國霞. 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌主要致病因子及其致病機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊 ，2006（5）2-5.

[4] 崔玉東，劉桂清，樸范澤.育成牛大腸桿菌腸毒血癥病原分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1994，20（1）：9-10.

[5] 陳明勇，陳德成，賈君鎮(zhèn)，等.牦牛腸毒素型大腸桿菌的分離鑒定和某些生物學(xué)特性的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：277-279.