• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    新疆地區(qū)回族、漢族人群HHBBVV基因型的分布與特點(diǎn)

    2014-12-26 09:18:10張紅梅徐嬌陽(yáng)劉鴻春余伍忠新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院新疆石河子83000蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所新疆烏魯木齊830000
    分子影像學(xué)雜志 2014年1期
    關(guān)鍵詞:差異檢測(cè)研究

    楊 柳,張紅梅,徐嬌陽(yáng),王 瑞,劉鴻春,王 錚,余伍忠新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 83000;蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所,新疆 烏魯木齊830000

    乙型肝炎病毒(HBV)為部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒,基因組長(zhǎng)約3.2 Kb,主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌,是我國(guó)當(dāng)前流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種傳染病。HBV基因序列高度變異,主要與病毒本身生物學(xué)特性有關(guān),根據(jù)全基因核苷酸序列異源性≥8%或S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%,可將HBV分成8種(A-H)不同的基因型[1],最近報(bào)道又新增了I型和J型[2-3]。大量證據(jù)表明,不同基因型的HBV的致病性存在差異,其基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有著密切的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)HBV基因型具有明顯的地域性分布,在我國(guó)以C型和B型為主[4]。為此我們利用二代高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)新疆烏魯木齊和伊犁兩地區(qū)的回族和漢族HBV患者進(jìn)行檢測(cè),了解其基因型分布及與臨床病情的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)告如下:

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 血清標(biāo)本來(lái)源 200例HBV感染血清分別于2012年9月和2013年1月采自新疆伊犁地區(qū)人民醫(yī)院和蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院的門診患者,包括回族94例,其中男性54例,年齡8~77歲,平均36.3±12.8歲,女性46例,年齡10~60歲,平均33.7±11.9歲;漢族100例,其中男性63例,年齡5~69歲,平均36.4±13.6歲,女性37例,年齡10~60歲,平均33.3±12.1歲。診斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。采用ELISA方法篩選HBsAg陽(yáng)性者,分離血清置-20℃凍存?zhèn)錂z。所有病例血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均為陰性,且入選對(duì)象均來(lái)自無(wú)親緣關(guān)系的回族、漢族人群,組間性別、年齡無(wú)顯著差異。

    1.2 方法

    1.2.1 乙肝五項(xiàng)檢測(cè) HBV標(biāo)記物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)檢測(cè)嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上??迫A生物工程股份有限公司)說(shuō)明書操作。

    1.2.2 HBV DNA定量檢測(cè) 病毒DNA提取采用簡(jiǎn)易煮沸法:待檢血清100 μl加至0.5 ml離心管中,加入100μl病毒提取液A,振蕩混勻后13000r/min離心10min,吸棄上清,再加入25 μl提取液B,振蕩混勻后100℃干浴10 min,13 000 r/min 離心10 min,上清2 μl立即用于FQ-PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR嚴(yán)格按照試劑盒購(gòu)自HBV定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。

    1.2.3 HBV DNA基因分型檢測(cè) 將HBV DNA定量檢測(cè)后的標(biāo)本200例,送天津華大健康科技有限公司進(jìn)行序列檢測(cè),獲得分型結(jié)果194例。

    1.2.4 HBV DNA測(cè)序分型結(jié)果判讀 根據(jù)HBV基因分型的標(biāo)準(zhǔn):全基因組核苷酸序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%,將HBV分為8個(gè)基因型,分別命名為AH。將檢測(cè)的HBV的DNA序列與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/view.cgi?db=2)上的參考序列比對(duì)以獲得分型結(jié)果。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理,組間均值比較用單因素方差分析,樣本率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn),其他采用四格表資料的Fisher確切概率法,以P<0.05判定有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 新疆回族HBV感染者的分型結(jié)果及基因型與HBV-DNA含量的關(guān)系

    HBV分型結(jié)果如圖1示。共獲得分型結(jié)果194例,其中回族94例,各基因型比例分別為:B型7例占7.44%,C型66例占70.21%,D型21例占22.34%。漢族100例,其各基因型比例分別為:B型23例占23%,C型57例占57%,D型12例占12%,B/C混合型8例占8%。未檢測(cè)到其他型別。4種分型在漢族和回族中總體分布不同(P<0.001)。漢族和回族中均以C型占優(yōu)勢(shì),但4種基因型在漢族和回族中的總體分布不同:C型和D型在回族的分布頻率大于漢族,而B型和混合型在漢族中的分布頻率大于回族。HBV基因定量檢測(cè)結(jié)果顯示,回族中D型HBV DNA的拷貝數(shù)最低,B型最高;漢族B/C混合型HBV DNA的拷貝數(shù)最低?;亍h族之間D基因型在HBV DNA拷貝數(shù)上有顯著差異(表1)。

    圖1 HBV基因分型結(jié)果圖(從左至右依次為B、C、D和B/C混合型)

    表1 回族患者HBV基因型分布及HBV DNA拷貝數(shù)比較

    2.2 基因型與不同性別、年齡患者的關(guān)系

    統(tǒng)計(jì)回、漢族男女性別各基因型結(jié)果表明,在94例回族標(biāo)本中,男性感染者B、C、D型分別為5(5/7)、37(37/66)、8(8/21)、女性感染者分別為2(2/7)、29(29/66)、13(13/21);漢族100例標(biāo)本中男性感染者B、C、D及B/C混合型分別14(14/23)、36(36/57)、8(8/12)、5(5/8),女性感染者分別為9(9/23)、21(21/57)、4(4/12)、3(3/8)。兩民族基因型在性別上無(wú)明顯差異(P>0.05)。將所檢測(cè)的患者年齡劃分為≤30歲、30~50歲和≥50歲3個(gè)時(shí)段,比較不同年齡段回、漢族HBV各基因型分布情況,發(fā)現(xiàn)年齡段在兩民族間的分布不完全相同(χ2=19.579,P<0.01),≤30和≥50的比較有差異,即漢族中≤30歲的人數(shù)較多;30~50歲和≥50歲的比較有差異,即在漢族30~50歲間的分布較多,50歲以上患者分布最少(表2)。

    表2 不同性別、年齡回族與漢族患者HBV基因型分布比較(n,×10-2)

    2.3 不同類型HBV感染者基因型分布

    回族94例中急性肝炎5例,無(wú)癥狀攜帶者22例,慢性乙型肝炎64例,肝硬化6例,肝細(xì)胞癌3例,其中有6例無(wú)癥狀攜帶者未分出型別。漢族100例中急性肝炎8例,無(wú)癥狀攜帶者3例,慢性乙型肝炎74例,肝硬化10例,肝細(xì)胞癌5例。通過對(duì)比顯示,感染分型在回族和漢族4種分型分布無(wú)差異(P=0.175和P=0.983),即感染分型在兩民族中分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5種臨床類型在4種分型分布中無(wú)差異(P=0.229)。HBV基因型在不同類型HBV感染者中的分布相同。不同病情患者基因型分布情況(表3)。

    表3 不同類型HBV感染者中HBV基因型分布

    3 討論

    乙型肝炎病毒引起的是一種世界性疾病,由于人口素質(zhì)和衛(wèi)生環(huán)境狀況的制約,在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率明顯增高?;颊吒腥綡BV后,可能逐漸演變?yōu)楦鼮閲?yán)重的肝病,如肝硬化、肝癌等,由此致使我國(guó)每年約50萬(wàn)人死亡,占全球因感染HBV導(dǎo)致肝衰、肝硬化、肝癌及并發(fā)癥而死亡的總?cè)藬?shù)的一半,高達(dá)57.6%[6]。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同基因型HBV的傳播途徑和致病性存在差異,其基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前多個(gè)國(guó)家的相關(guān)研究已證實(shí)在臨床參數(shù)中患者的人種和地理分布與HBV基因型之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最為密切[7]。通過HBV基因分型研究可以了解人口遷移并能更好地描述HBV感染的地理分布特點(diǎn)。以往研究認(rèn)為:A型主要見于歐洲、美國(guó)白種人和黑種人、非洲黑種人/南非、亞洲、印度;B型主要分布于中國(guó)大陸南部、中國(guó)臺(tái)灣、越南、日本、美國(guó)亞裔;C型主要見于中國(guó)大陸北部、日本、中國(guó)臺(tái)灣、中國(guó)香港、泰國(guó)、美國(guó)亞裔;D型主要分布于白種人(南歐)、阿拉伯人(北非及中東地區(qū))及印度;E型見于非洲西部和中部;F型存在于中南美洲、美國(guó)土著居民、波利尼西亞;G型流行于中美洲、美國(guó)、越南、法國(guó)、德國(guó);H型見于尼加拉瓜、墨西哥、美國(guó);最近發(fā)現(xiàn)的I型在越南和老撾,J型在琉球群島和日本。我國(guó)A、B、C、D等4個(gè)基因型都存在,北方城市以C基因型為主,由北至南,基因B型感染率逐漸升高,少數(shù)民族地區(qū)基因D型有較高的感染率[8]。

    新疆自古以來(lái)就是一個(gè)多民族不斷遷徙、融合、同化的多元文化區(qū)域,各民族雜居混居現(xiàn)象較為普遍,不同源人群在相同環(huán)境條件下,可以朝相同方向演化而形成趨同的體質(zhì)特征。遺傳物質(zhì)DNA的核苷酸序列,在自然界以一定的頻率發(fā)生變異。因此人群間的遷徙與混雜及血緣關(guān)系對(duì)基因頻率是有影響的。新疆有十三個(gè)世居民族,回族是第四大民族,是典型的融生性民族,即回族源流的多元性與形成方式的融合性[9]。本研究HBV基因分型結(jié)果顯示,新疆漢族C型顯著高于B型,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]?;刈?4例HBV樣品中,C型66例,D型21例,B型7例,未見基因型的重組,回族中C型占主導(dǎo),其次D型也高達(dá)22.3%。明顯高于楊少奇等寧夏地區(qū)回族HBV基因分型中D型占4.2%的報(bào)道[11];同樣與麗娜報(bào)道的新疆地區(qū)回族以B型為主D型次之,C型少見,且BC和CD混合型多見[12];以及馮琴等研究的C型(71.43%),B型(14.29%),D型(7.14%)的結(jié)果都不一致[13]。出現(xiàn)這種差異我們認(rèn)為首先是分型方法不同:目前用于HBV基因型分型的方法有多種,如基因序列測(cè)定法、聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因分型法、單克隆抗體ELISA基因分型法、基因型特異性引物PCR法、線性探針分析基因分型法和基因芯片法等。各種方法都有自己的優(yōu)勢(shì)和局限,楊少奇等采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性酶切分型法及部分測(cè)序分型,PCR-RFLP法[14]可因酶切位點(diǎn)易受基因變異影響,遇混合感染或酶切不完全時(shí),會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜條帶而影響結(jié)果判定。麗娜等采取基因型特異性引物巢式PCR法,由于選取的型特異性堿基聚集片段的保守性以及HBV DNA堿基變異等原因,會(huì)導(dǎo)致少數(shù)標(biāo)本的擴(kuò)增效應(yīng)降低。在PCR過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)污染等情況,形成非特異性條帶而導(dǎo)致誤判[15];馮琴利用PCR反向斑點(diǎn)雜交法是一種較靈敏的快速檢測(cè)HBV基因型的分子雜交的方法,但是該方法所選擇的區(qū)段性檢測(cè)準(zhǔn)確性可能受到HBV基因突變的考驗(yàn),同時(shí)其雜交區(qū)段過短,對(duì)于重組型的檢測(cè)準(zhǔn)確性也受到一定的質(zhì)疑[16]。隨著基因型概念的提出,測(cè)序成為主要鑒定基因型的方法,也是HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)和基礎(chǔ)。全基因序列分析不僅可靠,在基因分型的同時(shí)還可以了解不同基因型和不同株間的其它基因結(jié)構(gòu)特征[17]。本研究中,我們采用的是HBV DNA的直接測(cè)序法,通過設(shè)計(jì)上游和下游各1個(gè)引物來(lái)對(duì)整條序列進(jìn)行測(cè)序,該方法雖然操作比較復(fù)雜,但準(zhǔn)確度高。其次是地區(qū)差異:在排除檢測(cè)方法學(xué)、試劑的靈敏度、特異性不同的基礎(chǔ)上,可能與地區(qū)差異、病例選擇、收集范圍、樣本數(shù)量不同有關(guān)。之前新疆地區(qū)少數(shù)民族HBV基因分型研究中回族樣本量較少,來(lái)源也較局限,僅占研究民族中稀少比例,未做到回族人群的專項(xiàng)研究,不能準(zhǔn)確的體現(xiàn)該族群HBV基因型的真實(shí)情況。本組標(biāo)本來(lái)源于烏魯木齊和伊犁兩地,樣本量較已有報(bào)道大幅增加,其結(jié)果的代表性更為廣泛,反應(yīng)了新疆少數(shù)民族HBV基因型的地域分布和種族分布特點(diǎn)。但我們?nèi)孕钄U(kuò)大不同地區(qū)間的樣本量進(jìn)行深入研究,進(jìn)一步驗(yàn)證是否地域不同就是形成基因型頻率差異的原因。

    在楊少奇等[11]研究中納入了肝功能檢測(cè)指標(biāo)作為肝臟損害評(píng)判指標(biāo),對(duì)寧夏回族HBV基因型分布進(jìn)行研究,顯示感染C基因型的患者肝臟損害較明顯,并且與肝硬化、肝癌的關(guān)系更密切,而感染D基因型的患者肝臟損害較輕,預(yù)后可能較好。歐美研究表明,基因型D容易在較年輕的患者中發(fā)生原發(fā)性肝細(xì)胞癌,且D型與急性自限性肝炎相關(guān)。Oommen等[15]對(duì)249例慢性乙型肝炎兒童的研究發(fā)現(xiàn),HBV DNA的高復(fù)制水平和基因型D密切相關(guān)。而國(guó)內(nèi)童巧霞[20]等研究也顯示,基因型與臨床表型有關(guān):基因型B、C及混合型在重型肝炎、肝硬化及肝癌患者中的分布存在差異,混合型和D基因型僅見于重型肝炎、肝硬化患者。上述研究與本研究結(jié)果不同,本研究顯示,漢、回族中基因型在臨床表型中分布相同。出現(xiàn)這種差異的原因主要有以下兩點(diǎn):(1)本研究涉及肝臟,而肝臟自我修復(fù)力較強(qiáng),病情一般發(fā)展較慢,尤其病情較輕時(shí),病情發(fā)展更慢甚至恢復(fù),或可解釋本研究出現(xiàn)的結(jié)果。且本研究中顯示慢性肝炎占五種臨床分型的絕對(duì)優(yōu)勢(shì),占71.1%(P<0.001),也可佐證肝臟疾病一般發(fā)展較慢,多發(fā)展為慢性的情況;(2)致病性并不等同于臨床表型,目前普遍認(rèn)為[18-21]基因型C引起的炎性壞死及纖維化程度比B型更加嚴(yán)重,且C型與肝硬化和肝癌的關(guān)系更為密切,基因型C的累積生存率要明顯低于B型。但這種致病性比較是否可以轉(zhuǎn)化為臨床表型比較,即具體基因型致病性與相應(yīng)臨床表型的關(guān)系,未有統(tǒng)一共識(shí)。雖然越來(lái)越多的證據(jù)表明基因型致病性與相應(yīng)臨床表型有關(guān)系,但要肯定具體基因型致病性與相應(yīng)臨床表型的關(guān)系,還必須開展更多研究,包括大樣本的研究、短期及長(zhǎng)期影響的研究、人群預(yù)后研究以及病理生理研究,以獲得大量令人信服的結(jié)果來(lái)證實(shí)這種關(guān)系;(3)不排除地域差異、樣本量、檢測(cè)方法、感染分型的分類標(biāo)準(zhǔn)等造成的不同結(jié)果。所以參考以上文獻(xiàn)并結(jié)合本研究對(duì)象的區(qū)域性特點(diǎn),本研究結(jié)果可信,具有一定的科研價(jià)值,對(duì)于本地區(qū)流行病學(xué)資料也有一定補(bǔ)充。

    總之,HBV基因型有著多種類型,目前研究人員對(duì)于HBV基因型的一些方面的認(rèn)識(shí)還處于初級(jí)階段,很多領(lǐng)域還需要進(jìn)一步深入。但我們希望通過新疆少數(shù)民族地區(qū)HBV感染者基因分型的研究,能夠?qū)Ρ镜貐^(qū)HBV感染日常臨床診治工作、抗病毒治療療效相關(guān)性預(yù)測(cè)及慢性乙型肝炎患者個(gè)體化治療等起著重要的指導(dǎo)意義。

    [1] La Torre G,Nicolotti N,de Waure C,et al.An assessment of the effect of hepatitis B vaccine in decreasing the amount of hepatitis B disease in Italy[J].Virol J,2008,5(84):84.

    [2]Olinger CM,Jutavijittum P,Hübschen JM,et al.Possible new hepatitis B virus genotype,Southeast Asia[J].Emerg Infect Dis,2008,14(11):1777-80.

    [3] Tatematsu K,Tanaka Y,Kurbanov F,et al.A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype J[J].J Virol,2009,83(20):10538-47.

    [4] 謝碧霞,江家驥.HBV基因型、亞型及其臨床關(guān)系[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2006,22(12):1153-5.

    [5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華肝臟病雜志,2011,19(1):13-24.

    [6] Liang X,Bi S,Yang W,et al.Epidemiological serosurvey of hepatitis B in China--declining HBV prevalence due to hepatitis B vaccination[J].Vaccine,2009,27(47):6550-7.

    [7] 史鳴樹,閔建榮.乙型病毒性肝炎[J].2009:44.

    [8] Zeng G,Wang Z,Wen S,et al.Geographic distribution,virologic and clinical characteristics of hepatitis B virus genotypes in China[J].J Viral Hepat,2005,12(6):609-17.

    [9] 謝小冬,陜雪梅.回族起源的DNA證據(jù)[J].回族研究,2002(3):75-8.

    [10]張紅梅,楊 柳,桂俊豪,等.新疆維族、漢族人群HBV基因型的分布與特點(diǎn)[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2013,40(7):1339-42.

    [11]楊少奇,王戰(zhàn)會(huì),楊 力,等.回族乙型肝炎病毒基因型分布及其臨床意義[J].中華肝臟病雜志,2006,14(6):466-7.

    [12]麗 娜,馬玉霞,魯曉擘,等.5種少數(shù)民族HBV基因型分布及其特點(diǎn)[J].肝臟,2009,14(4):299-301.

    [13]馮 琴,朱善軍,劉秋梅,等.新疆克拉瑪依漢族和維族慢性乙型肝炎患者HBV基因型研究[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2010,21(5):110-1.

    [14]楊銀輝.病毒基因分型方法的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28(10):1102-4.

    [15]Oommen PT,Wirth S,Wintermeyer P,et al.Relationship between viral load and genotypes of hepatitis B virus in children with chronic hepatitis B[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2006,43(3):342-7.

    [16]Ali MM,Hasan F,Ahmad S,et al.Comparative evaluation of INNOLiPA HBV assay,direct DNA sequencing and subtractive PCRRFLP for genotyping of clinical HBV isolates[J].Virol J,2010,7:111.

    [17]Sanger F,Nicklen S,Coulson AR.DNA sequencing with chainterminating inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,1977,74(12):5463-7.

    [18]Alexopoulou A,Dourakis SP.Genetic heterogeneity of hepatitis viruses and its clinical significance[J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005,4(1):47-55.

    [19]Akuta N,Kumada H.Influence of hepatitis B virus genotypes on the response to antiviral therapies[J].J Antimicrob Chemother,2005,55(2):139-42.

    [20]童巧霞,吳艷艷,羅端德.湖北省地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型及其臨床意義[J].臨床內(nèi)科雜志,2006,23(2):126-8.

    [21]經(jīng)繼生,黃 培,阮成榮,等.江蘇省乙型肝炎病毒基因型分布與臨床相關(guān)性[J].肝臟,2006,11(5):335-6.

    猜你喜歡
    差異檢測(cè)研究
    相似與差異
    音樂探索(2022年2期)2022-05-30 21:01:37
    FMS與YBT相關(guān)性的實(shí)證研究
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    遼代千人邑研究述論
    視錯(cuò)覺在平面設(shè)計(jì)中的應(yīng)用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    找句子差異
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    生物為什么會(huì)有差異?
    黄色a级毛片大全视频| 香蕉丝袜av| 我的亚洲天堂| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产熟女午夜一区二区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 老鸭窝网址在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产一区二区三区综合在线观看| 黄片播放在线免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 1024香蕉在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产免费av片在线观看野外av| 男女高潮啪啪啪动态图| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产成人精品久久二区二区91| 在线观看一区二区三区| 日本黄色视频三级网站网址| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 免费看十八禁软件| 身体一侧抽搐| 很黄的视频免费| 国产精品久久久av美女十八| 精品久久久久久成人av| 精品国产美女av久久久久小说| 黄片播放在线免费| 成年人免费黄色播放视频| 精品久久久久久,| 人人澡人人妻人| 99久久综合精品五月天人人| 国产色视频综合| 亚洲九九香蕉| 久久天堂一区二区三区四区| 91字幕亚洲| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩免费高清中文字幕av| 久久亚洲真实| 丝袜在线中文字幕| 色婷婷av一区二区三区视频| 一a级毛片在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久精品国产综合久久久| av网站免费在线观看视频| 亚洲三区欧美一区| 日本wwww免费看| 美女午夜性视频免费| 两个人看的免费小视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 超碰成人久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 黄频高清免费视频| 国产真人三级小视频在线观看| 日韩欧美在线二视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品九九99| 欧美 亚洲 国产 日韩一| www.www免费av| 一级,二级,三级黄色视频| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲国产看品久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 少妇 在线观看| 深夜精品福利| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久人人精品亚洲av| 欧美大码av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 热re99久久精品国产66热6| e午夜精品久久久久久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一进一出好大好爽视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜视频精品福利| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久国产精品影院| 热99国产精品久久久久久7| 夜夜夜夜夜久久久久| 69av精品久久久久久| 一级a爱片免费观看的视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 午夜亚洲福利在线播放| 自线自在国产av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精品国产色婷婷电影| 十八禁人妻一区二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久精品人人爽人人爽视色| 免费少妇av软件| 在线观看舔阴道视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产精品一区二区三区四区久久 | 精品一品国产午夜福利视频| 免费看a级黄色片| 好男人电影高清在线观看| 国产精品久久久久成人av| 一进一出抽搐动态| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 搡老岳熟女国产| 亚洲 国产 在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 校园春色视频在线观看| 精品国产一区二区久久| bbb黄色大片| 日本一区二区免费在线视频| 国产国语露脸激情在线看| 香蕉国产在线看| 国产精品久久视频播放| 男女之事视频高清在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久热在线av| 亚洲欧美激情综合另类| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲,欧美精品.| 18禁观看日本| 欧美一区二区精品小视频在线| 美国免费a级毛片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 首页视频小说图片口味搜索| 黄色片一级片一级黄色片| 99热国产这里只有精品6| 午夜激情av网站| 天堂影院成人在线观看| 成人精品一区二区免费| 我的亚洲天堂| 正在播放国产对白刺激| 午夜久久久在线观看| 精品久久久久久成人av| av网站在线播放免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩高清综合在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品乱码久久久久久99久播| 国产不卡一卡二| 最好的美女福利视频网| 韩国精品一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 国产高清视频在线播放一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲熟女毛片儿| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 人人澡人人妻人| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久久久久精品吃奶| 91av网站免费观看| 亚洲五月婷婷丁香| 免费在线观看黄色视频的| av片东京热男人的天堂| 91麻豆av在线| 国产成人av激情在线播放| 久久 成人 亚洲| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品国产一区二区精华液| 99精品久久久久人妻精品| 一级作爱视频免费观看| 国产国语露脸激情在线看| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久国产成人精品二区 | av免费在线观看网站| 国产精品1区2区在线观看.| 黄色成人免费大全| 亚洲 国产 在线| 大型黄色视频在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 啦啦啦免费观看视频1| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 97碰自拍视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| av网站免费在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费看十八禁软件| 美女 人体艺术 gogo| 成人亚洲精品av一区二区 | 97碰自拍视频| 无遮挡黄片免费观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产黄a三级三级三级人| 午夜福利一区二区在线看| 久久久水蜜桃国产精品网| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品午夜福利视频在线观看一区| av天堂久久9| 精品国产国语对白av| 国产乱人伦免费视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 99re在线观看精品视频| 免费高清视频大片| 男女之事视频高清在线观看| 在线观看日韩欧美| 精品福利永久在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 欧美黄色淫秽网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久人妻av系列| 美女扒开内裤让男人捅视频| 高清在线国产一区| 校园春色视频在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲精品在线美女| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 免费高清视频大片| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 少妇的丰满在线观看| 成人影院久久| 韩国av一区二区三区四区| 欧美不卡视频在线免费观看 | 丁香欧美五月| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩亚洲高清精品| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 大香蕉久久成人网| 亚洲五月婷婷丁香| 午夜老司机福利片| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲精品av麻豆狂野| 韩国av一区二区三区四区| 黄色成人免费大全| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 无遮挡黄片免费观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 成年人免费黄色播放视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一夜夜www| 免费在线观看黄色视频的| 午夜成年电影在线免费观看| 在线国产一区二区在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩有码中文字幕| 中文字幕色久视频| 午夜久久久在线观看| 在线观看免费高清a一片| xxxhd国产人妻xxx| 99国产精品一区二区三区| 大型黄色视频在线免费观看| 99热只有精品国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品久久电影中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品在线美女| 国产蜜桃级精品一区二区三区| cao死你这个sao货| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲人成电影观看| 午夜免费激情av| 亚洲avbb在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲男人的天堂狠狠| 中文字幕最新亚洲高清| av电影中文网址| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 三上悠亚av全集在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精华国产精华精| 人妻久久中文字幕网| 一区二区三区国产精品乱码| 激情视频va一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 99国产精品99久久久久| 欧美日韩黄片免| 欧美黑人精品巨大| 国产三级黄色录像| 国产成人精品无人区| 亚洲精华国产精华精| 久久香蕉激情| 国产色视频综合| 国产单亲对白刺激| 国产精品野战在线观看 | 在线免费观看的www视频| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久久国内视频| aaaaa片日本免费| 久久人妻av系列| 欧美人与性动交α欧美软件| 老熟妇仑乱视频hdxx| 宅男免费午夜| 日韩视频一区二区在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 黄色片一级片一级黄色片| 免费在线观看日本一区| 亚洲成人免费电影在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久中文看片网| 欧美黑人欧美精品刺激| 交换朋友夫妻互换小说| a在线观看视频网站| 国产成人影院久久av| 精品一区二区三区四区五区乱码| av天堂久久9| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品久久视频播放| www.熟女人妻精品国产| 在线观看免费视频日本深夜| 男女下面进入的视频免费午夜 | 天天影视国产精品| 黄色女人牲交| 69av精品久久久久久| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 激情在线观看视频在线高清| 欧美在线黄色| 日本免费a在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜日韩欧美国产| 一本大道久久a久久精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 在线永久观看黄色视频| 视频在线观看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 天堂俺去俺来也www色官网| 天天影视国产精品| 日本a在线网址| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久国内视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产黄色免费在线视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 可以在线观看毛片的网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜免费观看网址| 欧美日韩乱码在线| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 窝窝影院91人妻| 成人国产一区最新在线观看| 天堂动漫精品| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男女床上黄色一级片免费看| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲五月天丁香| 男女高潮啪啪啪动态图| av免费在线观看网站| 黄片小视频在线播放| 制服诱惑二区| 窝窝影院91人妻| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久久久久午夜电影 | 欧美色视频一区免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美中文日本在线观看视频| 看免费av毛片| 一二三四在线观看免费中文在| 国产成人系列免费观看| 久久久久久大精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 色综合婷婷激情| 伊人久久大香线蕉亚洲五| videosex国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜日韩欧美国产| 嫩草影视91久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费在线观看亚洲国产| 色播在线永久视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 天天添夜夜摸| 久久草成人影院| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产真人三级小视频在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 在线免费观看的www视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 丝袜美腿诱惑在线| 最新在线观看一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 成年人免费黄色播放视频| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产一区二区三区视频了| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜两性在线视频| 色综合站精品国产| 精品久久蜜臀av无| 一区二区三区激情视频| 国产免费现黄频在线看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产成人精品无人区| 桃色一区二区三区在线观看| 咕卡用的链子| 国产又爽黄色视频| 午夜亚洲福利在线播放| 成人影院久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 女警被强在线播放| 黄色毛片三级朝国网站| 男人舔女人的私密视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 很黄的视频免费| 黑人操中国人逼视频| 亚洲中文字幕日韩| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 在线观看66精品国产| 久久久水蜜桃国产精品网| 两人在一起打扑克的视频| 9热在线视频观看99| 亚洲成人国产一区在线观看| 一进一出抽搐动态| www日本在线高清视频| 免费在线观看完整版高清| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黄色成人免费大全| 97碰自拍视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 他把我摸到了高潮在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲av美国av| 精品一区二区三区四区五区乱码| 激情在线观看视频在线高清| 十八禁网站免费在线| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲欧美激情在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 高清在线国产一区| 韩国精品一区二区三区| 一级片免费观看大全| 精品国内亚洲2022精品成人| 日本欧美视频一区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲情色 制服丝袜| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产色视频综合| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品日韩av在线免费观看 | 亚洲成国产人片在线观看| 午夜视频精品福利| 夜夜爽天天搞| 久久青草综合色| 国产一区在线观看成人免费| 久99久视频精品免费| 午夜激情av网站| 久久久久久久午夜电影 | 亚洲成人免费av在线播放| 久久九九热精品免费| 热99国产精品久久久久久7| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲全国av大片| 亚洲人成电影观看| 老司机亚洲免费影院| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日本三级黄在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 超色免费av| 超碰成人久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 91大片在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久99久视频精品免费| 亚洲中文字幕日韩| 黄色视频,在线免费观看| 黄色怎么调成土黄色| 两个人免费观看高清视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中国美女看黄片| 高清欧美精品videossex| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美黄色淫秽网站| 久久久久久人人人人人| 久久久久久久久久久久大奶| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 脱女人内裤的视频| 在线观看一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 欧美日韩精品网址| 亚洲黑人精品在线| 国产精品野战在线观看 | 91麻豆av在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产伦人伦偷精品视频| 日日夜夜操网爽| 久久亚洲精品不卡| 亚洲人成伊人成综合网2020| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 视频在线观看一区二区三区| 欧美日韩av久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产精品野战在线观看 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久人人精品亚洲av| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲av第一区精品v没综合| 色播在线永久视频| 成年人免费黄色播放视频| 人人澡人人妻人| 国产高清激情床上av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 黑丝袜美女国产一区| 国产高清国产精品国产三级| 天天影视国产精品| 国产成人欧美在线观看| 国产精品影院久久| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品免费视频内射| 国产伦人伦偷精品视频| 韩国av一区二区三区四区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久影院123| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 老司机福利观看| 久久久国产欧美日韩av| 美女 人体艺术 gogo| 午夜精品国产一区二区电影| 久久性视频一级片| 黄色成人免费大全| 免费搜索国产男女视频| 一级片免费观看大全| 高清欧美精品videossex| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲中文日韩欧美视频| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| xxxhd国产人妻xxx| videosex国产| 成人永久免费在线观看视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲av成人一区二区三| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲 欧美一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91大片在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩欧美三级三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产av一区二区精品久久| 国产高清videossex| 欧美午夜高清在线| 国产av一区在线观看免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲欧美精品综合久久99| 啦啦啦免费观看视频1| 老司机福利观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲少妇的诱惑av| 两人在一起打扑克的视频| 国产三级在线视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 搡老岳熟女国产| 人妻久久中文字幕网| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产男靠女视频免费网站| 免费在线观看亚洲国产| 免费看a级黄色片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产高清激情床上av| 正在播放国产对白刺激| 国产91精品成人一区二区三区| 精品第一国产精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费观看精品视频网站| 黄色视频不卡| 亚洲午夜理论影院| 黑丝袜美女国产一区|