楊 柳,張紅梅,徐嬌陽(yáng),王 瑞,劉鴻春,王 錚,余伍忠新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 83000;蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所,新疆 烏魯木齊830000
乙型肝炎病毒(HBV)為部分雙鏈環(huán)狀DNA病毒,基因組長(zhǎng)約3.2 Kb,主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌,是我國(guó)當(dāng)前流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種傳染病。HBV基因序列高度變異,主要與病毒本身生物學(xué)特性有關(guān),根據(jù)全基因核苷酸序列異源性≥8%或S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%,可將HBV分成8種(A-H)不同的基因型[1],最近報(bào)道又新增了I型和J型[2-3]。大量證據(jù)表明,不同基因型的HBV的致病性存在差異,其基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有著密切的關(guān)系。國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)HBV基因型具有明顯的地域性分布,在我國(guó)以C型和B型為主[4]。為此我們利用二代高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)新疆烏魯木齊和伊犁兩地區(qū)的回族和漢族HBV患者進(jìn)行檢測(cè),了解其基因型分布及與臨床病情的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)告如下:
1.1.1 血清標(biāo)本來(lái)源 200例HBV感染血清分別于2012年9月和2013年1月采自新疆伊犁地區(qū)人民醫(yī)院和蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院的門診患者,包括回族94例,其中男性54例,年齡8~77歲,平均36.3±12.8歲,女性46例,年齡10~60歲,平均33.7±11.9歲;漢族100例,其中男性63例,年齡5~69歲,平均36.4±13.6歲,女性37例,年齡10~60歲,平均33.3±12.1歲。診斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。采用ELISA方法篩選HBsAg陽(yáng)性者,分離血清置-20℃凍存?zhèn)錂z。所有病例血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均為陰性,且入選對(duì)象均來(lái)自無(wú)親緣關(guān)系的回族、漢族人群,組間性別、年齡無(wú)顯著差異。
1.2.1 乙肝五項(xiàng)檢測(cè) HBV標(biāo)記物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)檢測(cè)嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上??迫A生物工程股份有限公司)說(shuō)明書操作。
1.2.2 HBV DNA定量檢測(cè) 病毒DNA提取采用簡(jiǎn)易煮沸法:待檢血清100 μl加至0.5 ml離心管中,加入100μl病毒提取液A,振蕩混勻后13000r/min離心10min,吸棄上清,再加入25 μl提取液B,振蕩混勻后100℃干浴10 min,13 000 r/min 離心10 min,上清2 μl立即用于FQ-PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR嚴(yán)格按照試劑盒購(gòu)自HBV定量PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。
1.2.3 HBV DNA基因分型檢測(cè) 將HBV DNA定量檢測(cè)后的標(biāo)本200例,送天津華大健康科技有限公司進(jìn)行序列檢測(cè),獲得分型結(jié)果194例。
1.2.4 HBV DNA測(cè)序分型結(jié)果判讀 根據(jù)HBV基因分型的標(biāo)準(zhǔn):全基因組核苷酸序列差異≥8%或S基因序列差異≥4%,將HBV分為8個(gè)基因型,分別命名為AH。將檢測(cè)的HBV的DNA序列與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/view.cgi?db=2)上的參考序列比對(duì)以獲得分型結(jié)果。
所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理,組間均值比較用單因素方差分析,樣本率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn),其他采用四格表資料的Fisher確切概率法,以P<0.05判定有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
HBV分型結(jié)果如圖1示。共獲得分型結(jié)果194例,其中回族94例,各基因型比例分別為:B型7例占7.44%,C型66例占70.21%,D型21例占22.34%。漢族100例,其各基因型比例分別為:B型23例占23%,C型57例占57%,D型12例占12%,B/C混合型8例占8%。未檢測(cè)到其他型別。4種分型在漢族和回族中總體分布不同(P<0.001)。漢族和回族中均以C型占優(yōu)勢(shì),但4種基因型在漢族和回族中的總體分布不同:C型和D型在回族的分布頻率大于漢族,而B型和混合型在漢族中的分布頻率大于回族。HBV基因定量檢測(cè)結(jié)果顯示,回族中D型HBV DNA的拷貝數(shù)最低,B型最高;漢族B/C混合型HBV DNA的拷貝數(shù)最低?;亍h族之間D基因型在HBV DNA拷貝數(shù)上有顯著差異(表1)。
圖1 HBV基因分型結(jié)果圖(從左至右依次為B、C、D和B/C混合型)
表1 回族患者HBV基因型分布及HBV DNA拷貝數(shù)比較
統(tǒng)計(jì)回、漢族男女性別各基因型結(jié)果表明,在94例回族標(biāo)本中,男性感染者B、C、D型分別為5(5/7)、37(37/66)、8(8/21)、女性感染者分別為2(2/7)、29(29/66)、13(13/21);漢族100例標(biāo)本中男性感染者B、C、D及B/C混合型分別14(14/23)、36(36/57)、8(8/12)、5(5/8),女性感染者分別為9(9/23)、21(21/57)、4(4/12)、3(3/8)。兩民族基因型在性別上無(wú)明顯差異(P>0.05)。將所檢測(cè)的患者年齡劃分為≤30歲、30~50歲和≥50歲3個(gè)時(shí)段,比較不同年齡段回、漢族HBV各基因型分布情況,發(fā)現(xiàn)年齡段在兩民族間的分布不完全相同(χ2=19.579,P<0.01),≤30和≥50的比較有差異,即漢族中≤30歲的人數(shù)較多;30~50歲和≥50歲的比較有差異,即在漢族30~50歲間的分布較多,50歲以上患者分布最少(表2)。
表2 不同性別、年齡回族與漢族患者HBV基因型分布比較(n,×10-2)
回族94例中急性肝炎5例,無(wú)癥狀攜帶者22例,慢性乙型肝炎64例,肝硬化6例,肝細(xì)胞癌3例,其中有6例無(wú)癥狀攜帶者未分出型別。漢族100例中急性肝炎8例,無(wú)癥狀攜帶者3例,慢性乙型肝炎74例,肝硬化10例,肝細(xì)胞癌5例。通過對(duì)比顯示,感染分型在回族和漢族4種分型分布無(wú)差異(P=0.175和P=0.983),即感染分型在兩民族中分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5種臨床類型在4種分型分布中無(wú)差異(P=0.229)。HBV基因型在不同類型HBV感染者中的分布相同。不同病情患者基因型分布情況(表3)。
表3 不同類型HBV感染者中HBV基因型分布
乙型肝炎病毒引起的是一種世界性疾病,由于人口素質(zhì)和衛(wèi)生環(huán)境狀況的制約,在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率明顯增高?;颊吒腥綡BV后,可能逐漸演變?yōu)楦鼮閲?yán)重的肝病,如肝硬化、肝癌等,由此致使我國(guó)每年約50萬(wàn)人死亡,占全球因感染HBV導(dǎo)致肝衰、肝硬化、肝癌及并發(fā)癥而死亡的總?cè)藬?shù)的一半,高達(dá)57.6%[6]。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不同基因型HBV的傳播途徑和致病性存在差異,其基因型與乙型肝炎病情的進(jìn)展、臨床表現(xiàn)、治療耐藥、預(yù)后有著密切的關(guān)系。目前多個(gè)國(guó)家的相關(guān)研究已證實(shí)在臨床參數(shù)中患者的人種和地理分布與HBV基因型之間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最為密切[7]。通過HBV基因分型研究可以了解人口遷移并能更好地描述HBV感染的地理分布特點(diǎn)。以往研究認(rèn)為:A型主要見于歐洲、美國(guó)白種人和黑種人、非洲黑種人/南非、亞洲、印度;B型主要分布于中國(guó)大陸南部、中國(guó)臺(tái)灣、越南、日本、美國(guó)亞裔;C型主要見于中國(guó)大陸北部、日本、中國(guó)臺(tái)灣、中國(guó)香港、泰國(guó)、美國(guó)亞裔;D型主要分布于白種人(南歐)、阿拉伯人(北非及中東地區(qū))及印度;E型見于非洲西部和中部;F型存在于中南美洲、美國(guó)土著居民、波利尼西亞;G型流行于中美洲、美國(guó)、越南、法國(guó)、德國(guó);H型見于尼加拉瓜、墨西哥、美國(guó);最近發(fā)現(xiàn)的I型在越南和老撾,J型在琉球群島和日本。我國(guó)A、B、C、D等4個(gè)基因型都存在,北方城市以C基因型為主,由北至南,基因B型感染率逐漸升高,少數(shù)民族地區(qū)基因D型有較高的感染率[8]。
新疆自古以來(lái)就是一個(gè)多民族不斷遷徙、融合、同化的多元文化區(qū)域,各民族雜居混居現(xiàn)象較為普遍,不同源人群在相同環(huán)境條件下,可以朝相同方向演化而形成趨同的體質(zhì)特征。遺傳物質(zhì)DNA的核苷酸序列,在自然界以一定的頻率發(fā)生變異。因此人群間的遷徙與混雜及血緣關(guān)系對(duì)基因頻率是有影響的。新疆有十三個(gè)世居民族,回族是第四大民族,是典型的融生性民族,即回族源流的多元性與形成方式的融合性[9]。本研究HBV基因分型結(jié)果顯示,新疆漢族C型顯著高于B型,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]?;刈?4例HBV樣品中,C型66例,D型21例,B型7例,未見基因型的重組,回族中C型占主導(dǎo),其次D型也高達(dá)22.3%。明顯高于楊少奇等寧夏地區(qū)回族HBV基因分型中D型占4.2%的報(bào)道[11];同樣與麗娜報(bào)道的新疆地區(qū)回族以B型為主D型次之,C型少見,且BC和CD混合型多見[12];以及馮琴等研究的C型(71.43%),B型(14.29%),D型(7.14%)的結(jié)果都不一致[13]。出現(xiàn)這種差異我們認(rèn)為首先是分型方法不同:目前用于HBV基因型分型的方法有多種,如基因序列測(cè)定法、聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性基因分型法、單克隆抗體ELISA基因分型法、基因型特異性引物PCR法、線性探針分析基因分型法和基因芯片法等。各種方法都有自己的優(yōu)勢(shì)和局限,楊少奇等采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性酶切分型法及部分測(cè)序分型,PCR-RFLP法[14]可因酶切位點(diǎn)易受基因變異影響,遇混合感染或酶切不完全時(shí),會(huì)出現(xiàn)復(fù)雜條帶而影響結(jié)果判定。麗娜等采取基因型特異性引物巢式PCR法,由于選取的型特異性堿基聚集片段的保守性以及HBV DNA堿基變異等原因,會(huì)導(dǎo)致少數(shù)標(biāo)本的擴(kuò)增效應(yīng)降低。在PCR過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)污染等情況,形成非特異性條帶而導(dǎo)致誤判[15];馮琴利用PCR反向斑點(diǎn)雜交法是一種較靈敏的快速檢測(cè)HBV基因型的分子雜交的方法,但是該方法所選擇的區(qū)段性檢測(cè)準(zhǔn)確性可能受到HBV基因突變的考驗(yàn),同時(shí)其雜交區(qū)段過短,對(duì)于重組型的檢測(cè)準(zhǔn)確性也受到一定的質(zhì)疑[16]。隨著基因型概念的提出,測(cè)序成為主要鑒定基因型的方法,也是HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)和基礎(chǔ)。全基因序列分析不僅可靠,在基因分型的同時(shí)還可以了解不同基因型和不同株間的其它基因結(jié)構(gòu)特征[17]。本研究中,我們采用的是HBV DNA的直接測(cè)序法,通過設(shè)計(jì)上游和下游各1個(gè)引物來(lái)對(duì)整條序列進(jìn)行測(cè)序,該方法雖然操作比較復(fù)雜,但準(zhǔn)確度高。其次是地區(qū)差異:在排除檢測(cè)方法學(xué)、試劑的靈敏度、特異性不同的基礎(chǔ)上,可能與地區(qū)差異、病例選擇、收集范圍、樣本數(shù)量不同有關(guān)。之前新疆地區(qū)少數(shù)民族HBV基因分型研究中回族樣本量較少,來(lái)源也較局限,僅占研究民族中稀少比例,未做到回族人群的專項(xiàng)研究,不能準(zhǔn)確的體現(xiàn)該族群HBV基因型的真實(shí)情況。本組標(biāo)本來(lái)源于烏魯木齊和伊犁兩地,樣本量較已有報(bào)道大幅增加,其結(jié)果的代表性更為廣泛,反應(yīng)了新疆少數(shù)民族HBV基因型的地域分布和種族分布特點(diǎn)。但我們?nèi)孕钄U(kuò)大不同地區(qū)間的樣本量進(jìn)行深入研究,進(jìn)一步驗(yàn)證是否地域不同就是形成基因型頻率差異的原因。
在楊少奇等[11]研究中納入了肝功能檢測(cè)指標(biāo)作為肝臟損害評(píng)判指標(biāo),對(duì)寧夏回族HBV基因型分布進(jìn)行研究,顯示感染C基因型的患者肝臟損害較明顯,并且與肝硬化、肝癌的關(guān)系更密切,而感染D基因型的患者肝臟損害較輕,預(yù)后可能較好。歐美研究表明,基因型D容易在較年輕的患者中發(fā)生原發(fā)性肝細(xì)胞癌,且D型與急性自限性肝炎相關(guān)。Oommen等[15]對(duì)249例慢性乙型肝炎兒童的研究發(fā)現(xiàn),HBV DNA的高復(fù)制水平和基因型D密切相關(guān)。而國(guó)內(nèi)童巧霞[20]等研究也顯示,基因型與臨床表型有關(guān):基因型B、C及混合型在重型肝炎、肝硬化及肝癌患者中的分布存在差異,混合型和D基因型僅見于重型肝炎、肝硬化患者。上述研究與本研究結(jié)果不同,本研究顯示,漢、回族中基因型在臨床表型中分布相同。出現(xiàn)這種差異的原因主要有以下兩點(diǎn):(1)本研究涉及肝臟,而肝臟自我修復(fù)力較強(qiáng),病情一般發(fā)展較慢,尤其病情較輕時(shí),病情發(fā)展更慢甚至恢復(fù),或可解釋本研究出現(xiàn)的結(jié)果。且本研究中顯示慢性肝炎占五種臨床分型的絕對(duì)優(yōu)勢(shì),占71.1%(P<0.001),也可佐證肝臟疾病一般發(fā)展較慢,多發(fā)展為慢性的情況;(2)致病性并不等同于臨床表型,目前普遍認(rèn)為[18-21]基因型C引起的炎性壞死及纖維化程度比B型更加嚴(yán)重,且C型與肝硬化和肝癌的關(guān)系更為密切,基因型C的累積生存率要明顯低于B型。但這種致病性比較是否可以轉(zhuǎn)化為臨床表型比較,即具體基因型致病性與相應(yīng)臨床表型的關(guān)系,未有統(tǒng)一共識(shí)。雖然越來(lái)越多的證據(jù)表明基因型致病性與相應(yīng)臨床表型有關(guān)系,但要肯定具體基因型致病性與相應(yīng)臨床表型的關(guān)系,還必須開展更多研究,包括大樣本的研究、短期及長(zhǎng)期影響的研究、人群預(yù)后研究以及病理生理研究,以獲得大量令人信服的結(jié)果來(lái)證實(shí)這種關(guān)系;(3)不排除地域差異、樣本量、檢測(cè)方法、感染分型的分類標(biāo)準(zhǔn)等造成的不同結(jié)果。所以參考以上文獻(xiàn)并結(jié)合本研究對(duì)象的區(qū)域性特點(diǎn),本研究結(jié)果可信,具有一定的科研價(jià)值,對(duì)于本地區(qū)流行病學(xué)資料也有一定補(bǔ)充。
總之,HBV基因型有著多種類型,目前研究人員對(duì)于HBV基因型的一些方面的認(rèn)識(shí)還處于初級(jí)階段,很多領(lǐng)域還需要進(jìn)一步深入。但我們希望通過新疆少數(shù)民族地區(qū)HBV感染者基因分型的研究,能夠?qū)Ρ镜貐^(qū)HBV感染日常臨床診治工作、抗病毒治療療效相關(guān)性預(yù)測(cè)及慢性乙型肝炎患者個(gè)體化治療等起著重要的指導(dǎo)意義。
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