微波輔助提取和田玉棗環(huán)磷酸腺苷的工藝及與其他方法比較

王立霞

（陜西學(xué)前師范學(xué)院，陜西 西安 710100）

環(huán)磷酸腺苷 （簡(jiǎn)稱 cAMP，Adenosine 3′，5′-cyclic monophosphate）1957年由 Sutherland發(fā)現(xiàn)，它普遍存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，控制并調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝[1-3]。醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，至少40多種疾?。ò┌Y、冠心病、心源性休克、高血壓和心肌梗死等重大疾?。┡ccAMP代謝有關(guān)，人體缺乏cAMP或cAMP/cGMP值下降，會(huì)導(dǎo)致眾多疾病的發(fā)生。cAMP是棗中重要活性物質(zhì)[4-5]。據(jù)報(bào)道，棗成熟果肉中cAMP含量為一般動(dòng)植物的數(shù)千至數(shù)萬(wàn)倍，具有重要開發(fā)價(jià)值[6-7]。目前，已有關(guān)于cAMP在保健食品領(lǐng)域應(yīng)用的報(bào)道[8]。我國(guó)棗園面積已達(dá)150多萬(wàn)公頃，產(chǎn)量200萬(wàn)t，新疆和田地區(qū)憑借其獨(dú)特資源優(yōu)勢(shì)，近年棗業(yè)發(fā)展迅速，面積達(dá)30多萬(wàn)公頃[9]。作者已對(duì)不同產(chǎn)地、不同含水量、不同組織駿棗、灰棗中cAMP含量進(jìn)行了研究并得出結(jié)果，和田玉棗（山西省交城縣駿棗引種于和田后其商品名稱為和田玉棗）中cAMP含量相對(duì)最高。

微波輻射過程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)，達(dá)到物料內(nèi)部維管束和腺胞系統(tǒng)，胞內(nèi)溫度迅速上升，細(xì)胞膨脹破裂，胞內(nèi)有效成分自由流出，在較低的溫度下提取介質(zhì)。利用微波可更快、更均衡地加熱材料，并且實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)量和有更干凈的反應(yīng)物。關(guān)于cAMP的提取方法，作者已對(duì)傳統(tǒng)溶劑提取法進(jìn)行了研究，本研究中引入了微波輔助提取法，并對(duì)傳統(tǒng)溶劑提取法和微波輔助提取法進(jìn)行對(duì)比，以獲取微波輔助提取和田玉棗cAMP的最優(yōu)工藝參數(shù)。本研究成果為和田玉棗及其它棗品種cAMP的深入研究及開發(fā)利用提供了參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆和田玉棗，2012年10月采摘后烘干棗，棗去核經(jīng)40℃干燥，粉碎過60目篩，室溫下密封保存；cAMP標(biāo)品（純度≥99%），色譜純，德國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；甲醇 （純度99.8%），色譜純，加拿大Promptar公司生產(chǎn)；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。LS-200型大孔吸附樹脂，西安藍(lán)深特種樹脂有限公司生產(chǎn)。

1525型高效液相色譜儀，Waters公司制造；TDL-5型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司制造；UV2550型紫外可見分光光度計(jì)，Shimadzu公司制造；WD780BS微波爐，格蘭仕電器有限公司制造。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜檢測(cè)條件 色譜柱：Brava-BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相：甲醇-雙蒸水（pH 為 3）（體積比 10∶90）；體積流量 0.8 mL/min，紫外全波長(zhǎng)掃描（如圖1所示）確定檢測(cè)波長(zhǎng)257.0 nm，室溫，進(jìn)樣量 20 μL[10-12]。

圖1 cAMP標(biāo)準(zhǔn)品掃描圖譜Fig.1 Scanning images of standard cAMP

1.2.2 cAMP標(biāo)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱取cAMP標(biāo)品2.5 mg，置50 mL容量瓶，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，得0.05 mg/L cAMP標(biāo)品溶液。分別吸標(biāo)品溶液 1、2、3、4、5、6、7、8 mL 于 10 mL 容量瓶，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，得 5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL 系列標(biāo)品溶液，分別吸 20 μL 系列標(biāo)品溶液入色譜儀[13-14]，記錄色譜圖，以濃度為橫坐標(biāo)，以cAMP峰面積為縱坐標(biāo)線性回歸，得線性方程

1.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2 g（按1.1中所介紹方法制得），以料液比1∶15[9]分別溶解于體積分?jǐn)?shù)5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%的乙醇溶液，常溫浸泡8 h，300 W功率微波處理1 min，所得溶液離心、過濾、真空濃縮后用雙蒸水定容，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析，保留時(shí)間法定性。如圖2所示，樣品峰與標(biāo)品峰的保留時(shí)間幾乎一致，分別為8.253min和8.297 min，以后均按此法進(jìn)行檢測(cè)[15-16]。峰面積外標(biāo)法定量[8-9]，測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇中提取物的提取量（μg/g）。

圖2 樣品及標(biāo)品中cAMP色譜圖Fig.2 Chromatogram of cAMP in jujube sample and standard cAMP

1.2.4 微波提取條件對(duì)棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)影響微波輔助提取效果的主要因素有微波功率、微波時(shí)間、浸泡時(shí)間及液料比，對(duì)上述4因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取工藝參數(shù)[17-21]。在進(jìn)行微波輔助法提取的同時(shí)，與超聲波輔助法及傳統(tǒng)溶劑法進(jìn)行對(duì)比。

1）微波功率對(duì)棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2 g，以料液比1∶15加入體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液，常溫浸泡8 h，分別在100、200、300、400、500、600 W 功率下微波處理 1 min[22]。分別測(cè)定（方法見 1.2.3，下同）cAMP 提取量（μg/g），確定最佳提取功率。

2）微波時(shí)間對(duì)棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2 g，以料液比1∶15加入體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液，常溫浸泡8 h，300 W功率分別微波處理 1、2、3、4、5、6 min[23]。分別測(cè)定 cAMP 提取量（μg/g），確定最佳提取時(shí)間。

3）浸泡時(shí)間對(duì)棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉2 g，以料液比1∶15加入體積分?jǐn)?shù) 10%乙醇溶液， 分別常溫浸泡 0、2、4、6、8、10 h，300 W功率微波處理 3 min[24]。分別測(cè)定cAMP提取量（μg/g），確定最佳浸泡時(shí)間。

4）液料比對(duì)棗cAMP提取量的影響實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取和田玉棗粉 2 g， 分別以料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 加入體積分?jǐn)?shù) 10%乙醇溶液，常溫浸泡6 h，以300 W功率微波處理3 min。分別測(cè)定cAMP提取量（μg/g），確定最佳料液比。

5）正交實(shí)驗(yàn)：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)微波功率、微波時(shí)間、浸泡時(shí)間、料液比采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)選，以確定最佳微波工藝。因素水平設(shè)計(jì)見表1[25]。

表 1 L9（34）實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 L9（34） Orthogonal factor level table

1.2.5 和田玉棗cAMP的分離效果實(shí)驗(yàn) 用LS-200型大孔吸附樹脂做動(dòng)態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)[11]，計(jì)算和田玉棗cAMP的分離效率。

1）泄露曲線的研究試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取25 mL處理好的LS-200型樹脂裝玻璃層析柱，將和田玉棗粉以1∶15料液比加入體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液，按照2.2.5中最優(yōu)條件提取cAMP，過濾后真空濃縮，調(diào)整質(zhì)量濃度為30 μg/mL，pH為4，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附[11]：上樣體積流量1 mL/min，其間每管收集20 mL，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析，測(cè)流出液濃度，至流出液濃度與上樣液濃度相同時(shí)停止上樣，做泄露曲線，確定最佳上樣體積。

2）LS-200型樹脂的洗脫曲線：準(zhǔn)確稱取25 mL處理好的LS-200型樹脂裝玻璃層析柱，量取160 mL和田玉棗cAMP上樣液，調(diào)整質(zhì)量濃度為30 μg/mL，pH為4，以1 mL/min體積流量上柱吸附。先用蒸餾水洗脫，每50 mL收集一份，再用體積分?jǐn)?shù)35%乙醇洗脫，每20 mL收集一份，分別將洗脫液于50℃下真空濃縮除去溶劑，用蒸餾水定容于25 mL容量瓶中，過0.45 μm濾膜，進(jìn)樣分析，計(jì)算其cAMP含量，做洗脫曲線，并將洗脫液真空濃縮后冷凍干燥，測(cè)定其純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)棗cAMP提取量的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)棗cAMP提取量的影響見圖3?？梢姡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，cAMP提取量先增大后緩慢減小。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，cAMP提取量達(dá)到最高，為570.33 μg/g，僅比乙醇體積分?jǐn)?shù)10%時(shí)高1 μg/g，考慮能量節(jié)省及減少污染等因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)以10%為宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)cAMP提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on extracting content of cAMP

2.2 微波提取條件對(duì)棗cAMP提取量的影響

2.2.1 微波功率對(duì)棗cAMP提取量的影響 微波功率對(duì)棗cAMP提取量的影響見圖4。由圖可見，cAMP提取量隨微波功率的增大而先增大后緩慢減小，當(dāng)微波功率為300 W時(shí)，cAMP提取量最高為571.23 μg/g，故選擇微波提取功率300 W為宜。

圖4 微波功率對(duì)cAMP提取量的影響Fig.4 Effect of power of microwave wave on extracting content of cAMP

2.2.2 微波時(shí)間對(duì)棗cAMP提取量的影響 提取時(shí)間對(duì)棗cAMP提取量的影響見圖5。由圖可見，cAMP提取量隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)而先增大后緩慢減小，當(dāng)微波時(shí)間為3 min時(shí)，cAMP提取量最高為590.89 μg/g，故選擇微波提取時(shí)間3 min為宜。

2.2.3 浸泡時(shí)間對(duì)棗cAMP提取量的影響 浸泡時(shí)間對(duì)棗cAMP提取量的影響見圖6?？梢姡琧AMP提取量隨浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)而先增大后減小，這是由于適當(dāng)浸泡可促進(jìn)細(xì)胞中cAMP的溶出，但浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，cAMP又發(fā)生改變，當(dāng)浸泡時(shí)間為6 h時(shí)，cAMP提取量最高為621.35 μg/g，故選擇浸泡時(shí)間6 h為宜。

圖5 微波時(shí)間對(duì)cAMP提取量的影響Fig.5 Effect of microwave time on extracting content of cAMP

圖6 浸泡時(shí)間對(duì)cAMP提取量的影響Fig.6 Effect of soak period on extracting content of cAMP

2.2.4 料液比對(duì)棗cAMP提取量的影響 料液比對(duì)棗cAMP提取量的影響見圖7?？梢姡琧AMP提取量隨料液比的增大而先增大后趨于一致，當(dāng)料液比為 1∶25 時(shí)，cAMP 提取量最高為 651.65 μg/g， 故選擇料液比1∶25為宜。

圖7 料液比對(duì)cAMP提取量的影響Fig.7 Effect of liquid-solid ratio on extracting content of cAMP

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn) 按L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)處理及結(jié)果見表2，方差分析見表3。由極差分析可知，各因素對(duì)cAMP提取量影響的大小順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間＞微波功率＞料液比＞浸泡時(shí)間。微波輔助提取和田玉棗cAMP最優(yōu)工藝組合為A2B2C2D3，即微波功率300 W、微波時(shí)間3 min、浸泡時(shí)間6 h、料液比1∶30。由表3方差分析知，微波功率、微波時(shí)間、浸泡時(shí)間、料液比差異顯著。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 正交實(shí)驗(yàn)中提取量最高的組合為A2B2C3D1，正交表分析得出最佳組合為A2B2C2D3，對(duì)兩組工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，分別重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果表明，最優(yōu)組合A2B2C2D3的cAMP提取量為 795.63 μg/g，組合 A2B2C3D1提取量為723.59 μg/g，因此微波輔助提取和田玉棗cAMP最優(yōu)工藝條件為微波功率300 W、微波時(shí)間3 min、浸泡時(shí)間6 h、料液比 1∶30。

2.3 提取方法比較

采用傳統(tǒng)溶劑法[9]、超聲波輔助法[11]提取和田玉棗cAMP，并與2.2.5中微波輔助法最優(yōu)工藝進(jìn)行對(duì)比。3種方法工藝條件及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。可見，微波輔助法（提取量795.63 μg/g）明顯優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑法（620.28 μg/g），優(yōu)于超聲波輔助法（771.95 μg/g）。由于微波功率及微波時(shí)間短，故能耗少于超聲波輔助法。

表4 3種提取方法比較Table 4 Comparison of different extraction methods

2.4 和田玉棗cAMP分離純化效果

2.4.1 泄露曲線 LS-200型樹脂對(duì)和田玉棗cAMP的泄露曲線見圖8?？梢?，上樣160 mL，即第8份收集液以后流出液中cAMP含量開始升高，故將其確定為漏點(diǎn)。確定LS-200型樹脂最大上樣體積160 mL，即6.4倍樹脂體積。

圖8 LS-200型樹脂對(duì)和田玉棗cAMP的泄露曲線Fig.8 Leak curve of LS-200 resint adsorb cAMP from Hetianyuzao

2.4.2 LS-200型樹脂洗脫曲線 LS-200型樹脂洗脫曲線見圖9?？梢姡催^程中極少量cAMP洗脫下來(lái)，不影響cAMP得率。同時(shí)，HPLC色譜圖中發(fā)現(xiàn)大量雜質(zhì)被洗脫下來(lái)，第4份水洗物中吸收峰已很少，故確定脫除雜質(zhì)水洗體積200 mL（8倍樹脂體積）。35%乙醇洗脫第一份時(shí)，即有cAMP檢出，收集至第6份時(shí)，洗脫液幾乎不含cAMP，故確定體積分?jǐn)?shù)35%乙醇洗脫劑為120 mL，即4.8倍樹脂體積。

圖9 洗脫曲線Fig.9 Washing curve

經(jīng)計(jì)算和田玉棗cAMP分離效率為97.81%。洗脫過程發(fā)現(xiàn)，顏色最重流份中cAMP含量最高，沒有顏色流份中幾乎不含cAMP，說明cAMP和色素結(jié)合在一起，故得到cAMP粗品純度不高，為3.47%。粗品色譜圖見圖10

圖10 和田玉棗cAMP粗品色譜圖Fig.10 Chromatogram of cAMP in Hetianyuzao crude sample

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)單因素及正交實(shí)驗(yàn)分析，確定微波輔助提取和田玉棗cAMP的最優(yōu)工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)10%，微波功率300 W，微波時(shí)間3 min，浸泡時(shí)間6 h，料液比1∶30。在此工藝條件下，和田玉棗cAMP平均提取量為795.63 μg/g；影響和田玉棗cAMP提取量的各因素顯著順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間＞微波功率＞料液比＞浸泡時(shí)間。

通過對(duì)3種提取方法的比較，得知微波輔助法較傳統(tǒng)溶劑法提取量高，提取時(shí)間短；較超聲波輔助法提取量高，能耗低。

采用LS-200型樹脂分離純化和田玉棗cAMP的分離效率為97.81%。cAMP粗品純度為3.47%。

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