極低頻交變磁場對過氧化氫酶活性的影響

薛麗萍 ， 孟亞萍 ， 趙娟娟 ， 楊 哪 ， 徐學(xué)明 *，2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

過氧化氫酶（Catalase，CAT）可以催化 H2O2分解成H2O和O2，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)。該酶結(jié)構(gòu)中特殊的鐵卟啉環(huán)是其主要的活性中心[1]。過氧化氫酶不僅是生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，并在食品、醫(yī)藥、紡織、造紙、環(huán)保等行業(yè)具有重要的應(yīng)用[1-2]。對于許多帶金屬活性中心基團(tuán)的酶，其運(yùn)動(dòng)方向會(huì)在磁場作用下發(fā)生變化，并且洛侖茲力會(huì)使拉默半徑發(fā)生改變，從而導(dǎo)致大分子構(gòu)相發(fā)生扭曲或變形，最終改變酶的活性，細(xì)胞正常的生理活動(dòng)也會(huì)受到影響[3]。Haberditzl W首次報(bào)道了在非勻強(qiáng)磁場的作用下，過氧化氫酶的酶活發(fā)生可預(yù)估的增加，這可能是一種繼發(fā)效應(yīng)，即順磁性氧被加速從反應(yīng)部位移除[4]。Vainer L M等在1978年報(bào)道了靜磁場暴露下對過氧化氫酶和[Fe3+（EDTA）]2催化H2O2分解速率的影響，當(dāng)磁場強(qiáng)度達(dá)到0.8 T時(shí)，過氧化氫酶和 [Fe3+（EDTA）]2的催化速率分別提高了（20±5）%和（24±5）%[5]。張軍等研究了強(qiáng)穩(wěn)恒磁場對離體牛肝CAT構(gòu)象的影響，過氧化氫酶經(jīng)過0.23～0.61 T磁場處理，其紫外光譜和熒光光譜都出現(xiàn)了吸收峰的改變，同時(shí)酶活也有一定程度的增加[6]。目前，關(guān)于磁場對過氧化氫酶的影響的研究主要集中于脈沖磁場或者靜磁場，研究參數(shù)主要是磁場強(qiáng)度和脈沖數(shù)，而關(guān)于極低頻交變磁場對過氧化氫酶影響的研究較少。磁場是在一定空間區(qū)域內(nèi)連續(xù)分布的矢量場，N、S極不斷的交替變化的磁場稱為交變磁場。極低頻磁場通常是指頻率在0～300 Hz之間的磁場[7]。而世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）則將頻率在0～100 kHz之間的磁場統(tǒng)稱為極低頻磁場[8]。

作者所在課題組采用通電螺線管產(chǎn)生的交變磁場對過氧化氫酶進(jìn)行處理，考察了不同溫度、頻率、pH、磁場強(qiáng)度及時(shí)間對過氧化氫酶的活性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，初步探討極低頻交變磁場對過氧化氫酶的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

過氧化氫酶 2 000～5 000 U/mg Protein，Sigma進(jìn)口分裝；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、過氧化氫（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）、去離子水，國產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

螺線管極低頻交變磁場處理裝置，作者自行研制；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、MOS-450型AF-CD圓二色光譜儀，法國Biologic公司制造；AL204型電子天平、特斯拉計(jì)，國產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 極低頻交變磁場試驗(yàn)環(huán)境 極低頻交變磁場采用變頻電源生成35～400 Hz、最大功率2 000 W的正弦波，信號(hào)電流經(jīng)限流電阻并激勵(lì)螺線管，生成低頻交變磁場。樣品置于雙螺線管中心，且溫度由恒溫循環(huán)水浴控制，裝置如圖1所示。交變磁場強(qiáng)度由HT108型特斯拉計(jì)的縱向傳感器檢測，交變磁場頻率分別為 50、100、200、400 Hz； 磁場強(qiáng)度分別為 200、300、400、500 mT。

圖1 極低頻交變磁場裝置示意圖Fig.1 Extremely low frequency alternating magnetic field devices

1.3.2 酶活測定 將過氧化氫酶液放入極低頻磁場中處理一定時(shí)間后測定酶活，以相同溫度、相同時(shí)間且未經(jīng)過磁場處理的酶液作為對照。酶活測定方法參考Beers and Sizers方法并進(jìn)行改進(jìn)[9]。反應(yīng)池：1 cm石英比色皿，1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.18%過氧化氫 （溶于0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），0.1 mL酶液（溶于0.05 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液），1 mL去離子水，以去離子水為參比?；旌锨胺謩e在25℃水浴中保溫5 min。底物與酶液混合后立即在240 nm波長下測定吸光度變化，每10 s記錄一次吸光度A，根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線最初直線段的斜率（△A/t）計(jì)算酶活力。在1 min內(nèi)引起吸光度增加0.001所需的酶量為一個(gè)酶活單位（以U/min表示）。相對酶活的計(jì)算如式（1）。

1.3.3 不同磁場條件對過氧化氫酶酶活的影響

1）不同磁場暴露時(shí)間：固定溫度為25℃，酶液pH 7.0，磁場強(qiáng)度 200 mT，磁場頻率 50 Hz，磁化時(shí)間分別為 0.5、1、2、4、6、8 h。

2）不同磁場強(qiáng)度：固定溫度為25℃，酶液pH 7.0，磁化時(shí)間8 h，磁場頻率50 Hz，磁場強(qiáng)度分別為200、300、400、500 mT。

3）不同交變頻率：固定溫度為25℃，酶液pH 7.0，磁場強(qiáng)度200 mT，磁化時(shí)間8 h，磁場頻率分別為50、100、200、400 Hz。

4）不同溫度：固定酶液pH 7.0，磁場強(qiáng)度200 mT，磁化時(shí)間8 h，磁場頻率50 Hz，溫度分別為25、35、45、55 ℃。

5）不同酶液 pH：固定溫度為 25℃，時(shí)間 8 h，磁場強(qiáng)度200 mT，磁場頻率50 Hz，酶液pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0。

1.3.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)測定 將過氧化氫酶溶液在不同的磁場環(huán)境中暴露2 h，以未進(jìn)行磁化處理的酶液作為對照樣，通過圓二色譜儀測定，石英樣品池的光程為0.1 cm，掃描速度1 nm/s，過氧化氫酶質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL，測定波長范圍為 190～250 nm，圓二色譜數(shù)據(jù)為3次掃描平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 磁場暴露時(shí)間對過氧化氫酶的影響

從圖2可以看出，不論是否經(jīng)過磁場暴露，實(shí)驗(yàn)體系下過氧化氫酶的酶活都隨著時(shí)間的增加逐漸下降，并且呈現(xiàn)一定的波動(dòng)。在磁場強(qiáng)度200 mT，磁場頻率50 Hz的條件下，酶活在前2 h下降速度較快，而4 h處小幅上升，之后又緩慢下降。而對照組的酶活下降趨勢則較為平緩。從相對酶活的變化趨勢可以看出，前1 h的相對酶活都在100%以上，說明在此磁場條件下可以造成酶活提高。此后相對酶活的下降速度較快，同時(shí)在4 h處出現(xiàn)了波動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉勇等[10]報(bào)道的研究結(jié)果有相似之處，即0.15、0.30、0.45 T磁場處理后酶活性降低比較緩慢，并在開始一段時(shí)間內(nèi)酶活性明顯增大。本研究中酶活降低的速率大于對照樣品且波動(dòng)較大，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)中采用了極低頻交變磁場，在環(huán)境體系中會(huì)造成帶電蛋白質(zhì)表面形成不同方向的感應(yīng)電流，產(chǎn)生安培力而造成蛋白質(zhì)空間構(gòu)象變化[11]。而已有的文獻(xiàn)報(bào)道，采用穩(wěn)恒磁場和靜態(tài)磁化法，對酶的作用力較小。

圖2 過氧化氫酶在磁場處理不同時(shí)間的酶活和相對酶活變化Fig.2 Effect of time on the specific and relative enzyme activity of catalase under magnetic field

2.2 磁場強(qiáng)度對過氧化氫酶的影響

從圖3可以看出，不同磁場強(qiáng)度下，酶活都呈現(xiàn)下降趨勢，但變化趨勢不一?？傮w上，隨著磁場強(qiáng)度的增加，酶活下降速率增加。可以看出，在前1 h，500 mT磁場下酶活和相對酶活的下降速率最大，但同時(shí)此磁場條件下相對酶活出現(xiàn)了較大波動(dòng)，從2 h處的47.26%增加到4 h處的73.06%，可能是因?yàn)檫^氧化氫酶在較強(qiáng)的磁場強(qiáng)度下，側(cè)鏈形狀發(fā)生了變化，從而產(chǎn)生了不同的變化趨勢。

同時(shí)，相對酶活的變化趨勢波動(dòng)性更大，說明磁場強(qiáng)度可以更大程度地改變酶的結(jié)構(gòu)。酶活性隨磁場改變的無規(guī)律性是磁場改變酶活性效應(yīng)的一個(gè)特征，反映了磁場對酶的作用是高度非線性的生物學(xué)過程。酶的磁效應(yīng)極其復(fù)雜，影響因素眾多，“非線性”的表象正是其非線性作用本質(zhì)規(guī)律的反映[12]。

圖3 過氧化氫酶在不同磁場強(qiáng)度下的酶活和相對變化Fig.3 Effect of the magnetic field intensity on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.3 交變頻率對過氧化氫酶酶活的影響

從圖4可以看出，在不同交變頻率下酶活和相對酶活都呈現(xiàn)下降趨勢且不同頻率下酶活減小的速率不同。隨著頻率的增加，酶活減小的程度放緩。50 Hz頻率下的酶活始終大于其他3種轉(zhuǎn)速下的酶活。100 Hz下前2 h，酶活較高，相對酶活為102.84%，暴露4 h后則急劇減小到28.24%。200 Hz和400 Hz下酶活變化大體相同，都維持在較低的數(shù)值。說明頻率升高會(huì)影響酶的活性，尤其是較高的頻率會(huì)抑制酶活。頻率越高在蛋白質(zhì)表面感應(yīng)的環(huán)形分子電流頻率就越高，相鄰蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)內(nèi)部產(chǎn)生的交變安培力可能對其酶活有較大的影響。

圖4 過氧化氫酶在不同磁場頻率下的酶活和相對酶活變化Fig.4 Effect of the magnetic field frequency on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.4 磁場暴露下溫度對過氧化氫酶酶活的影響

從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)的4個(gè)不同溫度下，酶活的變化趨勢基本相同，酶活隨著時(shí)間的增加逐漸減小，同時(shí)在2～4 h之間出現(xiàn)了波動(dòng)，與前面所述時(shí)間變化趨勢大體相似。25℃條件下酶活始終高于其他條件下的，35℃和45℃條件下酶活大小交替增加，55℃下酶活始終處于較低的狀態(tài)。張軍[13]等對4℃和25℃、0.23 T磁場處理下離體過氧化氫酶研究發(fā)現(xiàn)，相同磁場在處理溫度不同的條件下，引起的磁效應(yīng)是不相同的，并且影響效應(yīng)隨溫度的增加趨于顯著。

與此同時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)25、35、45℃的相對酶活變化趨勢相差不大，只是減少的程度不同，這可能是過氧化氫酶的最適溫度不同造成的。而55℃的變化趨勢卻和前三者差異巨大，55℃條件下相對酶活急劇增加，最高點(diǎn)為相同時(shí)間、溫度下對照酶活的2 142.86%，由于過氧化氫酶在55℃放置8 h已經(jīng)完全失活酶活值為0，故8 h處相對酶活無法計(jì)算。究其原因，可能是因?yàn)闃O低頻磁場和高溫共同作用下較大程度地改變了過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)，使其更加趨于穩(wěn)定，獲得較好的相對耐高溫特性。這個(gè)推論將在后面的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖5 過氧化氫酶在不同溫度下的酶活和相對酶活變化Fig.5 Effect of temperature on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.5 酶液pH對過氧化氫酶酶活的影響

從圖6看出，pH影響酶活變化的趨勢較為明朗，且與之前所述變化趨勢大體一致。由于過氧化氫酶的最適pH是7.0，故最適pH周圍酶活較高，而在pH 5情況下酶活受到抑制，故酶活較低。相對酶活的變化趨勢與酶活變化相似，說明在磁場條件相同時(shí)，對酶的影響因素主要是pH，而這也是酶活和相對酶活變化較為規(guī)律的原因。pH不同則酶表面所帶電荷量有差異，在交變磁場下于酶表面產(chǎn)生的感應(yīng)電流大小有異則是對酶活造成影響的主要原因。

圖6 過氧化氫酶在不同pH下的酶活和相對酶活變化Fig.6 Effect of pH value on the specific and relative enzyme activity of catalase

2.6 磁場處理對二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜法（CD）是最常用的分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法，通過CD圖譜能分析計(jì)算α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等各組分的含量。典型α-螺旋結(jié)構(gòu)在 208、222 nm處有兩個(gè)負(fù)峰，典型β-折疊結(jié)構(gòu)在216 nm處有一個(gè)負(fù)峰[14]。由于溫度和磁場強(qiáng)度對酶活影響較大，故選擇了25℃、200 mT，25℃、500 mT，55℃、200 mT 3個(gè)磁場條件進(jìn)行CD遠(yuǎn)紫外圖譜掃描，并且做了對照組的掃描。

從圖7可以看到，在25℃下不同的磁場條件對過氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的影響，但是CD圖譜的形狀相差不大，可見二級(jí)結(jié)構(gòu)差異不大。對照組的圓二色光譜圖中在209、215 nm處有兩個(gè)明顯負(fù)峰，表明過氧化氫酶的二級(jí)構(gòu)象中同時(shí)存在α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，經(jīng)過200、500 mT磁場處理后，過氧化氫酶的CD圖譜發(fā)生了一些變化，209和215nm處的負(fù)峰值略有上升，并且隨著磁場強(qiáng)度的增強(qiáng)，負(fù)峰值逐漸上升。

圖7 25℃下不同處理方式過氧化氫酶的圓二色譜Fig.7 CD spectra of catalase treated under 25℃at different conditions

從表1的數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)過磁場處理，過氧化氫酶的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲的含量都有不同程度的變化。磁場條件25℃、200 mT處理的酶液與對照相比，α-螺旋含量急劇減少，β-折疊含量略有增加，β-轉(zhuǎn)角含量增加，無規(guī)卷曲含量減少。磁場條件25℃、500 mT處理的酶液與對照相比，α-螺旋含量急劇減少，β-折疊略有增加，β-轉(zhuǎn)角含量減少，無規(guī)卷曲含量增加。

表1 25℃不同處理?xiàng)l件下過氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 1 Composition of catalase secondary structure on 25℃under different treatment conditions

在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊均為有序結(jié)構(gòu)，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的增加將會(huì)增加酶的活性，反之減小則會(huì)減小酶的活性，因此又選擇了將α-螺旋和β-折疊總量作為一個(gè)參數(shù)來衡量酶二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。從表1中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過磁場處理后α-螺旋和β-折疊的總量小于對照組，且磁場強(qiáng)度越大，含量越少，這與之前的酶活結(jié)果一致。

同樣，如圖8所示，55℃對照的CD光譜圖中也存在兩個(gè)負(fù)峰，分別在210、222 nm附近，表明二級(jí)構(gòu)象中同時(shí)含有α-螺旋和β-折疊兩種結(jié)構(gòu)。55℃磁場處理的過氧化氫酶CD光譜圖中210、224 nm的負(fù)峰值明顯上升，且圖譜形狀發(fā)生較大變化。

圖8 55℃下不同處理方式過氧化氫酶的圓二色譜Fig.8 CD spectra of catalase treated under 25℃at different conditions

見表 2，55℃、200 mT條件下與對照相比，α-螺旋含量增加，β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角含量減少，無規(guī)卷曲含量也減少。由表2數(shù)據(jù)可知，55℃磁場處理后α-螺旋和β-折疊的總量大于對照組，且酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)整體上有向α-螺旋轉(zhuǎn)化的趨勢，因而提高了酶的活性。

表2 55℃不同處理?xiàng)l件下過氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成Table 2 Composition of catalase secondary structure on 55℃under different treatment conditions

綜合以上結(jié)果說明，在55℃、200 mT的磁場條件下，過氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，這也與之前酶活變化的結(jié)果吻合。故而推測過氧化氫酶在此極端條件下形成了具有相對耐高溫的結(jié)構(gòu)。

同時(shí)可以看到，經(jīng)過磁場暴露處理后，無論是25℃還是55℃，過氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分含量差別不大，但是跟對照樣品相比，各組分含量都有一定的變化，尤其是55℃條件下。這說明可能55℃、200 mT磁場會(huì)促使過氧化氫酶形成某種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)來抵抗外界條件的變化。

另外，由于過氧化氫酶的活性中心鐵卟啉環(huán)存在高自旋的Fe3+，25℃、200 mT，25℃、500 mT和55℃、200 mT 3種磁場對其的擾動(dòng)會(huì)影響酶的活性。由于蛋白質(zhì)分子的主鏈較為穩(wěn)固，而側(cè)鏈具有較大的柔性，有自由運(yùn)動(dòng)的能力。由此推測可能在25℃、200mT，25℃、500 mT和55℃、200 mT 3種磁場的作用下側(cè)鏈發(fā)生了一定程度的扭轉(zhuǎn)，形成了新的分布取向，從而改變了二級(jí)結(jié)構(gòu)各組分的數(shù)量。溫度升高，酶的構(gòu)象逐漸從鈍化態(tài)轉(zhuǎn)為活化態(tài)，其側(cè)鏈的運(yùn)動(dòng)自由度也增加[6]。溫度越高，磁場對側(cè)鏈分布的影響就越大，這也可能是55℃磁場處理后過氧化氫酶二級(jí)結(jié)構(gòu)與對照樣品相差較大的原因。同時(shí)，猜測高自旋的Fe3+很可能是一個(gè)主要的推動(dòng)力。由此推測磁場處理后過氧化氫酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)可能也有較大變化，而文獻(xiàn)也有類似報(bào)道[3]，具體的情況還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)語

1） 過氧化氫酶在 25～55 ℃、200～500 mT、50～400 Hz磁場處理下酶活隨著時(shí)間延長而出現(xiàn)不同程度的降低，并且伴有波動(dòng)。

2）不同磁場處理?xiàng)l件對過氧化氫酶的相對酶活影響程度不同，其中頻率、pH對相對酶活的影響較為平緩且有規(guī)律性，溫度和磁場強(qiáng)度對相對酶活的影響比較復(fù)雜，并且在55℃、200 mT條件下，形成了具有相對耐高溫的結(jié)構(gòu)。過氧化氫酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)CD圖譜顯示，55℃磁場處理后過氧化氫酶的α-螺旋和β-折疊的總量大于對照組，這與相對酶活變化的結(jié)果吻合。

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