埃博霉素B高產(chǎn)菌株的選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化

龔國(guó)利， 王 娜， 劉麗麗

（陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安710021）

埃博霉素（Epothilones）是粘細(xì)菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]，是一種新型的抗腫瘤藥物。其作用機(jī)制與紫杉醇相同，通過(guò)促微管聚合作用從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3-4]，并且與紫杉醇相比，埃博霉素具有毒性更小，水溶性更好[5]，對(duì)耐藥性細(xì)胞作用更強(qiáng)，抗腫瘤譜更廣等優(yōu)點(diǎn)，因此埃博霉素被譽(yù)為最具有潛力的抗腫瘤新藥之一。

然而埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量很低造成埃博霉素類(lèi)藥物生產(chǎn)成本很高。為了提高埃博霉素的產(chǎn)量，可進(jìn)行產(chǎn)物的異源表達(dá)以及生產(chǎn)菌株的選育。已有文獻(xiàn)[6-8]報(bào)道埃博霉素的異源表達(dá)已獲得成功，但是由于其對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用，使得產(chǎn)量并沒(méi)有提高，反而大幅度下降，所以通過(guò)天然產(chǎn)生菌株選育來(lái)獲得埃博霉素高產(chǎn)菌株仍然是最有效的方法。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法是20世紀(jì)中后期發(fā)展起來(lái)的優(yōu)化試驗(yàn)條件的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵條工藝的優(yōu)化[9-11]。作者以纖維堆囊菌SoF5-76為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變，成功獲得一株埃博霉素B高產(chǎn)菌株SoF5-H23，并進(jìn)一步通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 纖維堆囊菌SoF5-76（Sorangium cellulosum So F5-76）：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存菌。由作者所在實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選，經(jīng)過(guò)基因組重組技術(shù)選育獲得。經(jīng)過(guò)后期發(fā)酵工藝優(yōu)化埃博霉素B產(chǎn)量可達(dá)到35.24 mg/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）CNST 培 養(yǎng) 基 ：KNO30.05 g/dL，Na2HPO40.025 g/dL，MgSO4·7H2O 0.1 g/dL，F(xiàn)eCl30.001 g/dL，瓊脂2 g/dL，微量元素液 1 ml/L，pH 7.2。121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

2）M26培養(yǎng)基：土豆淀粉8.0 g/L，大豆蛋白胨2.0 g/L，葡萄糖 2.0 g/L，酵母粉 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl21.0g/L，EDTA-Fe3+1 mL/L， 微量元素1 mL/L，以KOH調(diào)節(jié)pH值為 7.2。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯淀粉3.9 g/L，脫脂奶粉2.2 g/L，無(wú)水氯化鈣1.3 g/L，葡萄糖1 g/L，豆餅粉1.5 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，EDTA-Fe3+3 mL/L， 微量元素0.5 mL/L，pH 7.4，樹(shù)脂XAD-16 2%。115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 Waters-2487-2420-1525高效液相色譜儀：美國(guó)waters公司；YXJ-2高速電動(dòng)離心機(jī)：金壇市精達(dá)儀器制造廠；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安儀器設(shè)備有限公司；HWS型恒溫恒濕箱：金壇市精達(dá)儀器制造廠；SHZ-82型氣浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造廠；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；磁力攪拌器：北京醫(yī)用離心機(jī)場(chǎng)；UV手提式殺菌燈：蘇凈集團(tuán)安泰公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 誘變處理

1）紫外誘變：取培養(yǎng)了36～48 h的M26培養(yǎng)物，離心，收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2～3次，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中打散，得到菌懸液，細(xì)胞濃度控制在106個(gè)/mL左右。取上述菌懸液5 mL于平皿中，將其放在磁力攪拌器上，置于15 W紫外燈下 30 cm 處，照射一定時(shí)間（30、60、90、120、150 s）后轉(zhuǎn)接入M26種子培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)2～4 h。取出后培養(yǎng)液按梯度稀釋并涂布VY/2平板，30℃恒溫培養(yǎng)5 d。以未經(jīng)過(guò)照射的菌懸液作為對(duì)照，觀察生長(zhǎng)情況并繪制致死率曲線。

2）亞硝基胍（NTG）誘變：取培養(yǎng)了 36～48 h 的M26培養(yǎng)物，離心，收集菌體，菌體用0.1 mol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液洗滌兩次，轉(zhuǎn)入帶玻璃珠的三角瓶中打散，得到菌懸液，細(xì)胞濃度控制在106個(gè)/mL左右。取10 mL滅菌離心管，裝入4.0 mL菌懸液，加入 NTG 母液，配置成含 200、400、600、800、1 000 μg/mL NTG的菌懸液，進(jìn)行誘變處理，30℃恒溫振蕩30 min。結(jié)束后立即用冷的生理鹽水離心洗滌終止誘變。然后轉(zhuǎn)接入M26種子培養(yǎng)基中避光培養(yǎng)2～4 h。取出后培養(yǎng)液按梯度稀釋并涂布VY/2平板，30℃恒溫培養(yǎng)5 d。以未經(jīng)過(guò)照射的菌懸液作為對(duì)照，觀察生長(zhǎng)情況并繪制致死率曲線。

1.2.2 培養(yǎng)方法

1）種子培養(yǎng)：將保藏在固體斜面培養(yǎng)基的菌種接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30℃下培養(yǎng)5～7 d，轉(zhuǎn)接于M26培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL三角瓶，在30℃、170 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)60 h后，得到作為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。

2）發(fā)酵培養(yǎng)：以10%接種體積分?jǐn)?shù)將所得種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵體系為：250 mL三角瓶裝液量50 mL，在30℃、200 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)6 d。

1.2.3 埃博霉素B產(chǎn)量測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束后，收集樹(shù)脂，用10倍體積甲醇振蕩浸提24 h后，棄去樹(shù)脂，甲醇浸提液放入真空干燥箱中烘干，再加入500 μL甲醇復(fù)溶，轉(zhuǎn)移到離心管中。采用HPLC定量分析，液相色譜條 件為： 色 譜柱 YWG，C18，10 μm，250 mm×4.6 mm；Waters-2487高效液相色譜儀；UV紫外檢測(cè)器：檢測(cè)波長(zhǎng)249 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35（體積比），上樣體積 20 μL，時(shí)間 30 min，流速 1 mL/min。埃博霉素B的定量采用本實(shí)驗(yàn)室用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程如下：

Y=0.132X+0.0035

采用HPLC檢測(cè)埃博霉素B所得的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成埃博霉素B產(chǎn)量。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman（P-B） 設(shè)計(jì) Plackett-Burman設(shè)計(jì)用來(lái)確定對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量有顯著影響作用的因子以及去除一些可有可無(wú)的因子。每個(gè)因子設(shè)置高低兩個(gè)水平， 分別用 “+”、“－“表示，用SAS9.2軟件設(shè)計(jì)。

1.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)篩選出的顯著因素的變化方向、步長(zhǎng)作了相應(yīng)的設(shè)計(jì)。

1.3.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn) 根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，確定顯著因子的高、中、低水平，表征為 1、0、-1，用SAS9.2軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 埃博霉素B高產(chǎn)菌株的誘變育種

2.1.1 紫外誘變 為了選擇合適的誘變處理時(shí)間，考察不同的紫外線照射時(shí)間對(duì)菌株的致死作用，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著紫外線照射時(shí)間延長(zhǎng)，菌株致死率升高，當(dāng)紫外照射時(shí)間為80 s時(shí)，菌株致死率接近100%。由于篩選突變株的最佳致死率應(yīng)控制在70%～85%，故最佳誘變時(shí)間確定為50 s。

2.1.2 NTG誘變 在進(jìn)行NTG誘變時(shí)，首先考察了不同誘變劑量對(duì)菌株的致死作用，誘變時(shí)間固定為30 min。細(xì)菌的一般處理質(zhì)量濃度為100～1 000 μg/mL[12]， 考察 NTG 終質(zhì)量濃度為 200、400、600、800、1 000 μg/mL時(shí)對(duì)菌株的致死作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。然后在最佳NTG終質(zhì)量濃度下，改變處理時(shí)間（10、30、50、70 min），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 3。

圖1 紫外對(duì)菌株的致死曲線Fig.1 Effect of UV on strain fatality rate

圖2 NTG質(zhì)量濃度對(duì)菌株的致死作用Fig.2 Effect of concentration of NTG on strain fatality rate

圖3 NTG誘變時(shí)間對(duì)菌株的致死作用Fig.3 Effect of mutagenesis time of NTG on strain fatality rate

從圖2和圖3可以看出，隨著NTG終質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的致死率都呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度為800 μg/mL時(shí)，菌株致死率接近100%，當(dāng)NTG終質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，菌株致死率為85%。當(dāng)NTG作用時(shí)間為30 min時(shí)，菌株致死率為80%，為了得到滿意的誘變結(jié)果，選擇致死率為80%～85%的致死濃度以及處理時(shí)間。故確定NTG誘變條件為：NTG終質(zhì)量濃度為400 μg/mL，處理時(shí)間為30 min。

2.1.3 復(fù)合誘變結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)紫外-NTG復(fù)合誘變，將誘變后的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，HPLC檢測(cè)埃博霉素B產(chǎn)量，最終獲得突變株SoF5-H23，其埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到79.83 mg/L，是出發(fā)菌株SoF5-76（35.24 mg/L）的2.27倍。

將篩選出的高產(chǎn)埃博霉素B的菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接傳代5次后，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，HPLC檢測(cè)埃博霉素B產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表1。表明試驗(yàn)篩選出的埃博霉素B的高產(chǎn)菌株遺傳性較穩(wěn)定。

表1 菌株SoF5-H23的遺傳穩(wěn)定性Table 1 Genetic stability of the strain SoF5-H23

2.2 突變高產(chǎn)菌株產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選重要影響因素根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響埃博霉素B產(chǎn)量的因素有：馬鈴薯淀粉、葡萄糖、豆餅粉、脫脂奶粉、七水硫酸鎂、無(wú)水氯化鈣、EDTA-Fe3+、微量元素、吸附樹(shù)脂、初始pH、裝液量、接種量、發(fā)酵溫度。本實(shí)驗(yàn)選用N=20的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，考察上述13個(gè)因素對(duì)埃博霉素B產(chǎn)量的影響。另設(shè)3個(gè)因素為虛擬變量，用于估計(jì)誤差。每個(gè)因素分別取兩個(gè)水平，以埃博霉素B產(chǎn)量為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，利用SAS9.2軟件對(duì)各因素主效應(yīng)分析的結(jié)果見(jiàn)表3。

P＜0.05為顯著因素，由表3可知，馬鈴薯淀粉（X1）、脫脂奶粉（X4）、初始 pH（X12）和溫度（X15）為影響埃博霉素B產(chǎn)量的顯著因素，在做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)，考察因素超過(guò)3個(gè)會(huì)使試驗(yàn)次數(shù)顯著增加，在4個(gè)顯著因素中溫度的影響相對(duì)較小，選擇馬鈴薯淀粉（X1）、脫脂奶粉（X4）、初始 pH（X12）三個(gè)因素進(jìn)一步做響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。其余不顯著的變量的取值結(jié)合效應(yīng)的正負(fù)和節(jié)約正本的原則，進(jìn)行調(diào)整。

2.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析的結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需要，在最陡爬坡試驗(yàn)中對(duì)埃博霉素 B產(chǎn)量影響顯著的因素的變化方向、步長(zhǎng)作了相應(yīng)的設(shè)計(jì)，具體取值和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，最佳因素的質(zhì)量濃度條件處于0+2Δ和0+3Δ之間，故以0+3Δ水平為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及響應(yīng)值Table 2 Plackett-Burman design variables（in clded levels） with Epothilone B as response

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)中各因素的效應(yīng)分析Table 3 Levels of variables and analysis of the main effect for Plackett-Burman

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 三個(gè)重要因素的水平取值見(jiàn)表5，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 5 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken

以埃博霉素B產(chǎn)量為響應(yīng)值，根據(jù)表6中實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用SAS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，獲得的回歸方程為：

Y=107.547+8.943X1-6.334X2-1.241X3-12.591X1X1-7.943X1X2-4.248X1X3-12.608X2X2+3.300X2X3-11.833X3X3

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表7，模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表8。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 ANOVA of regression model

由表 7 可知，模型極顯著（Pr＞F 小于 0.01）；失擬項(xiàng)在 0.1水平上不顯著（P=0.100 8＞0.1），說(shuō)明殘差均由隨機(jī)誤差引起，因此模型選擇正確。R2=0.983 2，說(shuō)明模型可以解釋98.32%響應(yīng)值的變化，表明方程擬合較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和預(yù)測(cè)值之間具有較好的一致性。Y的變異系數(shù)CV表示實(shí)驗(yàn)的精確度，CV值越高，實(shí)驗(yàn)的可靠性越低，本實(shí)驗(yàn)中CV值相對(duì)較低，說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)操作可靠。

由表8方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明：模型一次項(xiàng) X1和 X2極顯著； 二次項(xiàng) X1X1、X1X2、X1X3、X2X2、X3X3對(duì)響應(yīng)值有顯著的影響，且X1（土豆淀粉）和X2（脫脂奶粉）有交互作用，交互作用顯著，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程應(yīng)該控制好碳氮比。

表8 回歸方程中回歸系數(shù)的T值檢驗(yàn)Table 8 Test of significance for regression coefficient

2.2.4 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件確定 利用SAS軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面分析圖及其等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖4～6?？疾焖鶖M合的響應(yīng)曲面的形狀，每個(gè)響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用，此時(shí)第三個(gè)變量保持在中心點(diǎn)水平不變。曲面圖的形狀可反應(yīng)出各單因素對(duì)埃博霉素B的影響，曲面越陡峭，影響越顯著。從其等高線圖可以直觀看出兩因素的交互作用，等高線的形狀反映出交互作用效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，等高線形狀越接近橢圓形表示交互作用越強(qiáng)。

圖 4 Y=f（X1，X2）響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X1，X2）

圖 5 Y=f（X1，X3）響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X1，X3）

圖6 Y=f（X2，X3）響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the function Y=f（X2，X3）

從圖中及軟件分析，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即存在極值點(diǎn) （X1，X2，X3） 使得響應(yīng)變量Y取得最大值。通過(guò)嶺脊分析（ridge analysis）得到極大值所對(duì)應(yīng)的各主要因素（X1，X2，X3）的編碼值分別為（0.514 228，-0.430 58，-0.200 42），即馬鈴薯淀粉、脫脂奶粉、初始pH的最佳取值分別為4.757 1 g/L、2.284 7 g/L、7.399 8，此時(shí)埃博霉素 B產(chǎn)量達(dá)到最高為111.42 mg/L。

2.3 模型的驗(yàn)證

為了證明預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在以上確定的最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，驗(yàn)證結(jié)果埃博霉素B產(chǎn)量為108.67 mg/L與預(yù)測(cè)結(jié)果十分接近，說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合性，模型的有效性，證明用響應(yīng)面法來(lái)尋找最佳發(fā)酵條件是可行的。

3 結(jié)語(yǔ)

工業(yè)微生物的菌種選育工作在發(fā)酵工業(yè)中占有重要的地位，是決定該發(fā)酵產(chǎn)品能否具有工業(yè)化生產(chǎn)價(jià)值及發(fā)酵過(guò)程成敗的關(guān)鍵。已有文獻(xiàn)[12]報(bào)道，通過(guò)對(duì)纖維堆囊菌進(jìn)行NTG化學(xué)誘變，獲得兩株埃博霉素A產(chǎn)量為17.3、17.4 mg/L的優(yōu)良菌株。作者在選育方法上采用物理方法與化學(xué)方法相結(jié)合對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，以此獲得高產(chǎn)菌株的目的。

作者以纖維堆囊菌SoF5-76為誘變出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和亞硝基弧復(fù)合誘變處理和選育，獲得一株高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定性較好的突變菌株SoF5-H23，其發(fā)酵產(chǎn)埃博霉素B的量可達(dá)79.83 mg/L，比出發(fā)菌株提高了1.27倍。

通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)纖維堆囊菌產(chǎn)埃博霉素B的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵工藝為：馬鈴薯淀粉4.8 g/L、脫脂奶粉2.3 g/L、無(wú)水氯化鈣 2 g/L、葡萄糖 0.5 g/L，豆餅粉2 g/L，七水硫酸鎂 2 g/L，EDTA-Fe3+2 mL/L，微量元素（TE）0.5 mL/L，吸附樹(shù)脂2%，培養(yǎng)基初始pH 7.4，裝液量50 mL，接種體積分?jǐn)?shù)8%，溫度30℃。在此最優(yōu)條件下埃博霉素B產(chǎn)量為 108.67 mg/L，比優(yōu)化前提高了55.62%。

為了提高埃博霉素B的產(chǎn)量，作者首先對(duì)菌株進(jìn)行誘變選育，獲得一株高產(chǎn)菌株，使得埃博霉素B產(chǎn)量從35.24 mg/L提高到79.83 mg/L（產(chǎn)量提高了1.27倍），然后對(duì)發(fā)酵工藝優(yōu)化，使得埃博霉素B產(chǎn)量達(dá)到108.67 mg/L，又提高了36.13%，整個(gè)過(guò)程中菌株誘變是產(chǎn)量提高的關(guān)鍵，分析產(chǎn)量提高的原因可能為：本研究的供試菌株是以四株野生菌為出發(fā)菌株通過(guò)Genome shuffling遞歸原生質(zhì)體融合獲得的菌株[13]，多株野生菌含有更加多樣的遺傳信息，通過(guò)遞歸原生質(zhì)體融合技術(shù)，累積了大量正突變效應(yīng)，通過(guò)本研究的理化復(fù)合誘變和發(fā)酵工藝優(yōu)化可能會(huì)使這種正效應(yīng)凸顯出來(lái)，獲得了較高的埃博霉素產(chǎn)量。此產(chǎn)量是國(guó)內(nèi)外報(bào)道的埃博霉素最高發(fā)酵產(chǎn)量，表明傳統(tǒng)生物工程技術(shù)在工業(yè)微生物領(lǐng)域仍然具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

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