人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒臨床應(yīng)用及初步評價(jià)＊

武警北京市總隊(duì)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科（北京100141）

王述蓮 鄧中平△ 呼建民 戴立忠△ 黃基容 王 軍△ 艾穎娟△

人類巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）亦稱細(xì)胞包涵體病毒，為皰疹病毒科β屬的雙螺旋DNA病毒，由于感染的細(xì)胞腫大，并具有巨大的核內(nèi)包涵體，所以稱為巨細(xì)胞病毒。HCMV的感染途徑主要為接觸、輸血、宮內(nèi)和產(chǎn)道等，感染較常見于胎兒、新生兒、孕婦等，孕婦感染可致新生兒先天畸形［1］。當(dāng)機(jī)體免疫缺陷或免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)下，極易受HCMV感染，如器官移植后接受免疫抑制治療、惡性腫瘤化療后、艾滋病患者等，這些患者一旦感染，常致較高的病死率和嚴(yán)重的疾?。?］。

目前國內(nèi)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測HCMV-DNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測中，但這些試劑盒多半以煮沸法提取核酸，且其檢測靈敏度不高，約在10000copies／ml左右；另外，這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。

最近，新出現(xiàn)了一種人巨細(xì)胞病毒核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法），它完全免去了核酸提取中煮沸過程。根據(jù)其說明，HCMV核酸濃縮后經(jīng)核酸釋放劑裂解，全部釋放參與到PCR反應(yīng)中，整個(gè)過程無污染、操作極其簡單、迅速。本研究擬通過檢測臨床樣本，將其與市場上的煮沸試劑進(jìn)行比對，來評估這一新方法準(zhǔn)確性及特異性。

材料與方法

1 研究對象 本次研究共檢測血清樣本192例，其中男性97例（50．5%），女性95（49．5%），年齡0d至37歲，-20℃冰箱保存。

2 主要試劑和儀器 試劑購自湖南圣湘生物科技有限公司，采用濃縮一步法技術(shù)處理樣本（以下簡稱“新型試劑”或“濃縮一步法試劑”），具有內(nèi)標(biāo)監(jiān)控假陰性，最低檢測限為400copies／ml；同時(shí)，選擇一種臨床使用較多的國產(chǎn)HCMV核酸檢測試劑，采用煮沸法提取樣本核酸，沒有內(nèi)標(biāo)監(jiān)控，作為對照試劑，最低檢測限為1000copies／ml。核酸擴(kuò)增儀采用美國Applied Biosystems公司的ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

3 方 法 采用兩種熒光定量PCR檢測試劑對192例臨床樣本（每例樣本一分為三，保留一份樣本作為復(fù)檢）進(jìn)行檢測，方法如下：

煮沸法：取50μl臨床樣本，加入50μl DNA提取液充分混勻，100℃恒溫處理10min，12 000rpm 離心5min備用；取5μl作為PCR反應(yīng)的模板，加入分裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中上機(jī)檢測。

濃縮一步法：取100μl血清樣本，加入等體積的濃縮液，12 000rpm離心5min，棄上清，加入50μl核酸釋放劑，用槍頭挑起沉淀，吸打幾次，將沉淀打散混勻靜置10min作為待測樣本備用。在PCR反應(yīng)管中加入10μl待檢樣本，吸打混勻，加入40μl PCR反應(yīng)液，吸打混勻上機(jī)檢測即可。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)進(jìn)行一致性分析，靈敏度、特異度分析和Kappa檢驗(yàn)一致性分析。

結(jié) 果

1 擴(kuò)增曲線對比：兩種試劑對比檢測結(jié)果表明：濃縮一步法試劑檢測樣本擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增曲線挺拔美觀，呈典型的“S”型；體系中含有內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)曲線整齊集中，可以很好的判斷檢測樣本中是否具有PCR抑制物，避免假陰性。

2 根據(jù)煮沸法試劑檢測結(jié)果將臨床樣本分為陽性組和陰性組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 煮沸法試劑與濃縮一步法試劑檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 濃縮一步法試劑與煮沸法試劑檢測結(jié)果的一致性分析：總一致性百分比符合率＝（a＋d）／（a＋b＋c＋d）＝（101＋85）／192×100%＝96．88%，用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，Kappa值等于0．973，說明兩方法高度一致。

4 濃縮一步法試劑與HCMV-pp65抗原結(jié)果的對比統(tǒng)計(jì)分析，見表2。

表2 濃縮一步法試劑的準(zhǔn)確性評價(jià)

靈敏度Se＝a／（a＋c）×100%＝80／（80＋8）×100%＝90．91%；特異度Sp＝d／（b＋d）×100%＝79／（25＋79）×100%＝75．96%；靈敏度Se＋特異度Sp＝90．91%＋75．96%＝166．87%＞100%。

5 煮沸法試劑與HCMV-pp65抗原結(jié)果的對比統(tǒng)計(jì)分析，見表3。

表3 煮沸法試劑的準(zhǔn)確性評價(jià)

6 不符樣本的復(fù)核結(jié)果及其分析：根據(jù)結(jié)果，有6例樣本（樣本信息見表4）濃縮一步法試劑與煮沸法試劑檢測結(jié)果不符，其中4例（編號分別為：230814、231061、231128以及231952）煮沸法試劑檢測為陰性（檢測濃度處于400～1000copies／ml且樣本性狀相對復(fù)雜），而濃縮一步法試劑檢測為陽性（檢測濃度高于400copies／ml）；另2例（編號為230949、231812）煮沸法試劑檢測為陽性，而濃縮一步法試劑檢測為陰性。在兩個(gè)試劑盒的靶基因擴(kuò)增區(qū)域外圍序列，設(shè)計(jì)引物對，對這6例樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測序復(fù)核，結(jié)果4例濃縮一步法試劑檢測為陽性的樣本測序結(jié)果均包含HCMV-DNA序列，可能其靈敏度較之煮沸法試劑更高或抗干擾能力更強(qiáng)；而煮沸法試劑檢測陽性的2例樣本無PCR擴(kuò)增片段，懷疑為交叉污染所致。

表4 6例不符樣本臨床信息表

應(yīng)用Kappa評價(jià)方法對濃縮一步法試劑和煮沸法試劑檢測結(jié)果進(jìn)行診斷一致性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0．05。對Kappa值的參考評價(jià)原則如下：0．75＜κ≤1時(shí)，診斷一致性好；0．4＜κ≤0．75時(shí)，診斷一致性一般；0≤κ≤0．4時(shí)，診斷一致性差。經(jīng)SPSS15．0軟件Kappa檢驗(yàn)的輸出結(jié)果顯示，Kappa值＝0．973，P＝1．000。α＝0．05檢驗(yàn)水準(zhǔn)下，濃縮一步法試劑與煮沸法試劑檢測結(jié)果的一致性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，診斷一致性好。

討 論

HCMV感染常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有血清學(xué)檢查、抗原血癥檢測及基于PCR技術(shù)的檢測方法等。血清學(xué)方法很多，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是最常用的方法，有靈敏度高、特異性好和重復(fù)性好等長處，方法簡單，不需要特殊儀器，但該方法靈敏度明顯不如抗原血癥檢測，且不利于早期診斷。最常用于抗原血癥檢測的抗原為pp65，它是HCMV活動性感染的早期標(biāo)志性產(chǎn)物，是目前監(jiān)測HCMV活動性感染和指導(dǎo)抗病毒治療的重要方法，但是pp65抗原血癥檢測僅適合于血標(biāo)本，且標(biāo)本要求及時(shí)處理。PCR技術(shù)由于高靈敏度、高特異性、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，使其為人巨細(xì)胞病毒的檢測提供了又一新的途徑。定量PCR的出現(xiàn)，打破PCR只能定性的局面，其中熒光定量PCR以其高靈敏度、高特異性、低污染率、實(shí)時(shí)監(jiān)測等特點(diǎn)，可為臨床提供更加準(zhǔn)確、客觀的檢測結(jié)果，并及時(shí)地了解病情及預(yù)后［4］。目前國內(nèi)臨床上主要采用煮沸法對人巨細(xì)胞病毒的核酸進(jìn)行提取，具體是先將樣本高速離心，再加裂解液，煮沸，高速離心，取上清為模板。該方法核酸提取過程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長，且在處理樣本時(shí)，經(jīng)過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，同時(shí)由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污。

本研究對人巨細(xì)胞病毒熒光定量PCR檢測方法與常規(guī)的煮沸法進(jìn)行對比研究。整個(gè)臨床試驗(yàn)過程均在嚴(yán)格控制下進(jìn)行，由經(jīng)專門培訓(xùn)的測試人員進(jìn)行檢測分析。用濃縮一步法檢測，處理簡單，無需加熱，可大大減少污染的發(fā)生，擴(kuò)增和熒光檢測均由儀器自動進(jìn)行，通過查看樣本的Ct值判斷陰陽性。

本次研究共檢測樣本192例，根據(jù)煮沸法試劑檢測結(jié)果分為兩組：其中陽性組103例，陰性組89例。新型人巨細(xì)胞病毒核酸檢測試劑與煮沸法試劑的陽性一致性百分比98．06%，陰性一致性百分比95．51%，總一致性百分比96．88%；對6例不符樣本的復(fù)核結(jié)果表明：6例樣本的測序結(jié)果均與新型試劑相符。對復(fù)核后的結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)一致性分析：結(jié)果Kappa值＝0．973，表明新型試劑與煮沸法試劑及復(fù)核檢測的結(jié)果具有很好的一致性。在與HCMV-pp65抗原檢測結(jié)果的對比中，兩種試劑均表現(xiàn)出較好的準(zhǔn)確性。

整個(gè)品評過程發(fā)現(xiàn)，濃縮一步法的樣本處理和檢驗(yàn)過程在一個(gè)離心管和一個(gè)PCR反應(yīng)管中即可完成，樣本中的核酸在濃縮液和核酸釋放劑的作用下釋放并參與到PCR反應(yīng)過程中，只需一次離心，無需加熱，抗污染能力強(qiáng)，操作過程簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性大大提高，對操作人員的技術(shù)要求較低。濃縮一步法還可以節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間，可以讓臨床醫(yī)生及患者及早得到診斷結(jié)果，避免等待試驗(yàn)結(jié)果的焦慮。從兩種試劑的擴(kuò)增曲線來看濃縮一步法試劑檢測樣本擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增曲線平滑、挺拔美觀，呈典型的“S”型；體系中含有內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)曲線整齊集中，曲線優(yōu)美。

通過本次對比品評可以看出，濃縮一步法擴(kuò)增檢測方法操作極其簡單，減少污染環(huán)節(jié)，有內(nèi)標(biāo)監(jiān)控假陰性，結(jié)果準(zhǔn)確，比已上市的煮沸法試劑具更好的靈敏度和準(zhǔn)確性，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］ Syggelou A，Iacovidou N，Kloudas S，etal．Congenital cytomegalovirus infection［J］．Ann N Y Acad Sci，2010，1205（2）：144-147．

［2］ Tania Crough，Rajiv Khanna．Immunobiology of human cytomegalovirus：From bench to bedside［J］．Clinical Microbiology Reviews，2009，22（1）：76–98．

［3］ 舒焰紅，趙 楊．活動性人巨細(xì)胞病毒感染的病毒基因表達(dá)特點(diǎn)［J］．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（24）：4113-4115

［4］ Revello MG，Gorini G，Gerna G．Clinical evaluation of a chemiluminescence immunoassay for determination of immunoglobulin g avidity to human cytomegalovirus［J］．Clin Diagn Lab Immunol，2004，11（4）：801-805．