基因擴增聯(lián)合測序法對痰標本分離的60株真菌病原學鑒定＊

陜西省人民醫(yī)院檢驗科（西安710068）

胡淑玲 安 娜△ 劉先寧△▲ 張利俠 王亞妮△ 朱娟莉△ 朱秀萍△

隨著廣譜抗生素、激素和免疫抑制劑等藥物的廣泛應用，以及腫瘤患者、老年病人抵抗力的下降，使得深部真菌感染的機會愈來愈多。肺部感染居深部真菌感染的首位，如不及時診治，病死率極高?？焖佟蚀_的診斷是治療和搶救的關鍵。PCR技術的發(fā)展，使痰標本中真菌種屬的快速鑒定得以實現(xiàn)。采用內(nèi)轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer region，ITS）序列分析已用于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關系分析［1］。本文采用已建立的PCR擴增ITS2區(qū)聯(lián)合基因序列比對方法［2］，對痰標本分離的60株真菌和2種標準真菌株進行種屬鑒定，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 材料來源 收集2012年2月至9月，在陜西省人民醫(yī)院就診，檢驗科細菌室進行痰標本分離培養(yǎng)、涂片后顯微鏡檢確診為真菌的菌落標本60份。本組病例中，男51例，女9例，平均年齡（72．5±0．5歲）。病人來自呼吸科、老年病腫瘤科、老年病呼吸科、神經(jīng)內(nèi)科、干部病房科、血液病科等。標準真菌菌株：煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus），白色念珠菌（Candida albicans）均購于陜西省微生物研究所菌種保藏中心。

2 試劑與儀器 真菌基因組DNA提取試劑盒DNeasy Plant Mini Kit購于德國 Qiagen公司；2×Taq plus PCR Master Mix購于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker購于大連Ta Ka Ra生物工程有限公司；引物合成和PCR產(chǎn)物測序由上海生工生物工程有限公司完成；Mastercycler gradient PCR儀購于德國Eppendorf公司；電泳儀和紫外分析儀購于北京六一儀器廠。

3 檢測方法

3．1 真菌 DNA 提?。簠⒁娢墨I［3，4］，分別取標準菌株菌落及痰標本分離的真菌菌落約10mg置于5ml離心管中，加液氮研磨成粉狀，然后按照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書的提取步驟提取真菌基因組DNA，得到10～50ng／μl的DNA溶液。

3．2 PCR擴增ITS2區(qū)：PCR擴增引物采用通用引物序列，引物ITS1的序列（5′～3′）為 TCCGTAGGTGAACCTGCGG，其長度為19bp，引物ITS4的序列（5′～3′）為 TCCTCCGCTTATTGATATGC，其長度為20bp。PCR反應體系：總體積30μl，其中模板為提取的真菌DNA 2μl（陰性對照用等體積的無菌去離子水），引物ITS1，ITS4 各 1μl，2×Taq plus PCR Master Mix 15μl，無菌去離子水11μl；反應程序95℃預變性5min后，95℃30s，55℃ 1min，72℃1 min共計35個循環(huán)，72℃延伸6min，-20℃保存?zhèn)溆?。擴增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往上海生工生物工程有限公司進行DNA測序。

3．3 序列比對與種屬分析：測序結果采用美國國立生物 信 息 中 心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST工具，基因庫中真菌核酸序列比對，確定其種屬并進一步進行分析。

結 果

1 PCR擴增ITS2區(qū)的檢驗結果 瓊脂糖凝膠電泳顯示，2種標準菌株以及痰標本分離的真菌菌株在500bp左右有擴增條帶。

2 PCR產(chǎn)物測序及真菌種屬鑒定結果 PCR反應產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定后測序，測序結果使用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具，并與基因庫中的真菌核酸序列比對，鑒定真菌種屬。2種標準菌的PCR產(chǎn)物序列經(jīng)比對與基因庫中一致。60株痰標本分離的真菌株與基因庫中的真菌核酸序列比對后，曲霉菌屬24株，青霉菌屬4株，念珠菌屬29株，其它絲狀菌還有暗孢節(jié)菱孢菌2株，淡紫擬青霉菌1株和串珠狀赤霉菌1株。結果見附表。

附表 60株痰標本分離的真菌株種屬及構成比

討 論

近年來，深部真菌感染的發(fā)病率不斷上升。2004年的調查結果表明，真菌感染率為20世紀90年代的2．4倍，2003年北京協(xié)和醫(yī)院統(tǒng)計的侵襲性真菌感染發(fā)生率是20世紀90年代的3．6倍 ，且以念珠菌屬和曲霉菌屬為主［5，6］。

本研究采用基因測序法對痰標本分離的60例真菌進行種屬分析，其中念珠菌菌屬占48%，曲霉菌屬占40%，青霉菌占5%，其它絲狀菌占7%，與上述研究結果一致。另外還檢測到了暗孢節(jié)菱孢菌（3%）、串珠狀赤霉菌（2%）等罕見報道的真菌。

致病性真菌的鑒定對深部真菌感染的診治具有重要意義，目前臨床上仍以表型鑒定為主，但該方法專業(yè)技術要求較高，耗時長，且對某些致病菌種往往不能準確鑒定［7］。而以基因序列為鑒定基礎的分子生物學方法對具有種間差異性和種內(nèi)保守性的目標區(qū)域進行PCR擴增，隨后進行序列測定，并在數(shù)據(jù)庫中比對得到鑒定結果，這種測序的方法由于客觀、可重復性好等優(yōu)點，目前在病原真菌的鑒定中常被認為是分子鑒定的 “金標準”［8］。

基因測序法能快速、簡便、準確地鑒別痰培養(yǎng)的真菌種屬，為本地區(qū)呼吸道真菌性疾病病原菌流行病學調查及個性化治療奠定基礎。

［1］ Balajee SA，Borman AM，Brandt ME，etal．Sequencebased identification of Aspergillus，fusarium，and mucorales species in the clinical mycology laboratory：Where are we and where should we go from here？［J］．J Clin Microbiol，2009，47（4）：877-84．

［2］ 劉先寧，胡淑玲，安 娜，等．半巢氏PCR擴增聯(lián)合基因測序鑒定絲狀真菌的實驗研究［J］．現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2014，28（50）：48-52．

［3］ 安 娜，王亞妮，劉先寧，等．真菌性角膜炎致病菌種屬的PCR鑒定［J］．眼科新進展，2010，30（11）：1017-1020．

［4］ 楊瀟遠，李振勇，屈超義．角膜炎常見致病真菌DNA快速提取方法的探索［J］．中華檢驗醫(yī)學雜志，2005，（9）：86．

［5］ 馬 軍．侵襲性真菌感染的流行病學［J］．中華醫(yī)學雜志，2005，85（21）：1443-1444．

［6］ 劉正印，盛瑞媛，李旭麗，等．院內(nèi)真菌感染149例分析［J］．中華醫(yī)學雜志，2003，83（5）：399-402．

［7］ Cuenca Estrella M，Bernal-Martinez L，Buitrago MJ，etal．Update on the epidemiology and diagnosis of invasive fungalinfection［J］．Int J Antimicrob Agents，2008，32Suppl 2：S143-147．

［8］ Balajee SA，Borman AM，Brandt ME，etal．Sequence based identification of Aspergillus，fusarium，and mucorales species in the clinical mycology laboratory：Where are we and where should we go from here7［J］．J Clin Microbiol，2009，47：877-884．