和厚樸酚脂質(zhì)體的制備及表征

吳德強(qiáng)

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 江西南昌330006）

和厚樸酚（honokiol）是厚樸中的主要有效成分之一，是厚樸發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，和厚樸酚除了具有抗炎、抗菌、抗氧化、拮抗鈣調(diào)素、調(diào)節(jié)胃腸功能等多種藥理活性[1～2]，還具有明顯的抗腫瘤活性[3～5]。由于結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，所以穩(wěn)定性不好，容易被氧化。尤其是其水溶性差，大大限制了和厚樸酚的制劑開發(fā)和臨床應(yīng)用。脂質(zhì)體作為一種藥物載體，可以將一些不穩(wěn)定、易氧化的藥物包封在脂質(zhì)體中，藥物因受到脂質(zhì)體雙層膜的保護(hù)，在很大程度上提高了藥物的穩(wěn)定性，又解決了難溶性藥物的溶解性，延長了和厚樸酚在血液中的半衰期。同時(shí)利用腫瘤新生血管的增強(qiáng)滲透和滯留（EPR）效應(yīng)，使藥物借助納米脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)往腫瘤部位靶向遞藥。本研究設(shè)計(jì)將和厚樸酚包裹于脂質(zhì)體中，改善和厚樸酚穩(wěn)定特性和溶解性；同時(shí)利用腫瘤EPR被動靶向作用提高和厚樸酚的治療效果；以包封率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)篩選并優(yōu)化了其處方和制備工藝，旨在探索包封率高、緩控釋給藥的和厚樸酚脂質(zhì)體。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 采用RE-52型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝器儀研究院）；粒徑與ζ電位分析儀（model 380XLS，Nicomp TM，Santa Barbara，CA，USA）；島津高效液相色譜系統(tǒng)；島津SPD-10A紫外檢測器；3K透析袋（綠鳥科技）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；超濾管（MW 3000，Millipore）；XW280A 型旋渦混合器（上海青浦滬儀器廠）；透射電鏡（Joel JEM-1230，Japan）。

1.2 試劑 大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)）；膽固醇購于美國sigma公司；和厚樸酚（深圳美荷生物科技有限公司）；甲醇（色譜純）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 和厚樸酚脂質(zhì)體的制備 采用薄膜水化-擠出法制備和厚樸酚脂質(zhì)體：精密稱取大豆卵磷脂、膽固醇、和厚樸酚置于茄形瓶中，加入乙酸乙酯使脂質(zhì)完全溶解。將茄形瓶置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40℃減壓蒸發(fā)有機(jī)溶劑，使脂質(zhì)溶液形成一層均勻薄膜。真空干燥過夜，使溶劑除盡。加入磷酸鹽緩沖液（PBS）水化，探頭超聲。水化液經(jīng) 0.80、0.45、0.22 μm 濾膜高壓擠出，得和厚樸酚脂質(zhì)體混懸液，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 和厚樸酚脂質(zhì)體包封率測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：大連依利特C18柱（150 mm×416 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -水 -冰乙酸（70∶30∶0.2）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：254 nm；柱溫：25℃。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制質(zhì)量濃度為0.5、2.0、5.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL 的一系列和厚樸酚對照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積和質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=54 610－2 125.8（R2=0.999 8），在 0.5～20.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度和回收率均符合分析要求。

2.2.3 包封率測定 和厚樸酚脂質(zhì)體包封率測定采用超濾法：精密移取0.3 mL脂質(zhì)體膠體溶液于超濾管中，離心10 min，吸取下層液，甲醇稀釋后，取20 μL按照2.2.1條件測定藥物含量。計(jì)算未包封的和厚樸酚量（M1）。另外精密移取0.3 mL脂質(zhì)體膠體溶液，用甲醇破乳后測定和厚樸酚，計(jì)算膠體溶液中和厚樸酚量（M2），計(jì)算包封率（EE%），計(jì)算公式為 EE%=（M2－M1）/M2。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化和厚樸酚脂質(zhì)體質(zhì)體處方 脂質(zhì)體制備工藝因素及處方因素都會影響脂質(zhì)體的藥物包封率，所以，本研究在前期試驗(yàn)時(shí)采用單因素分析方法考察薄膜分散法制備和厚樸酚脂質(zhì)體的一些工藝和處方條件，在單因素考察的基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化和厚樸酚脂質(zhì)體處方和制備工藝。

2.3.1 因素和水平的選擇 在單因素考察的基礎(chǔ)上，以脂質(zhì)體的包封率為考察指標(biāo)。選擇影響脂質(zhì)體包封率的主要因素：磷脂與藥物的重量比（A）、磷脂與膽固醇的重量比（B）、水相介質(zhì)種類（C）及超聲時(shí)間（D）4個(gè)對包封率影響較大的因素作為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平。見表1。

表1 因素水平表

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 選用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表安排9次試驗(yàn)，制得和厚樸酚脂質(zhì)體，分別測定和厚樸酚包封率。見表2。根據(jù)正交試驗(yàn)表，從極差R來看，各因素對包封率的影響大小次序?yàn)椋篈＞B＞C＞D。在試驗(yàn)所選的范圍內(nèi)，超聲時(shí)間對和厚樸酚包封率的影響最小，磷脂與藥物的重量比對包封率影響最大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并綜合經(jīng)濟(jì)原則，最后確定最佳工藝和處方條件為A1B1C3D1，即磷脂與藥物的重量比為60∶1，磷脂與膽固醇的重量比為20∶1，水化介質(zhì)為pH 6.5磷酸鹽緩沖液，超聲時(shí)間為6 min。

2.4 工藝驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述優(yōu)化處方和工藝的穩(wěn)定性和可行性，以優(yōu)化出的最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，和厚樸酚包封率結(jié)果可從表3中看出，用優(yōu)化后的處方和工藝制備的和厚樸酚脂質(zhì)體包封率比其他正交試驗(yàn)的結(jié)果都更好，說明優(yōu)化成功，優(yōu)化處方和工藝穩(wěn)定、可行。見表3。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 酚脂質(zhì)體理化表征 采用上面優(yōu)化的處方和工藝條件制備和厚樸酚脂質(zhì)體，通過測定粒徑和體外藥物的累積釋放率對其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。

2.5.1 粒徑分布 采用粒度/Zeta電位測定儀，測定和厚樸酚脂質(zhì)體的粒徑分布。為防止多散射現(xiàn)象，樣品均用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度后測定。結(jié)果和厚樸酚脂質(zhì)體粒徑呈現(xiàn)正態(tài)分布趨勢，平均粒徑為150 nm左右，非常有利于通過EPR效應(yīng)進(jìn)入腫瘤組織。

2.5.2 和厚樸酚脂質(zhì)體體外釋放 采用透析法考察和厚樸酚脂質(zhì)體的體外釋放行為。釋放介質(zhì)為含0.5%吐溫-80的PBS溶液[6]。取1 L和厚樸酚脂質(zhì)體溶液加入到預(yù)溶脹的透析袋內(nèi)（MWCO=5 000 Da），扎緊袋口，放入裝有50 mL釋放介質(zhì)的容器中，于37℃恒溫水浴，100 rpm振蕩下進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。按照預(yù)先設(shè)定時(shí)間從釋放介質(zhì)中取樣0.5 mL，同時(shí)補(bǔ)入等量37℃空白釋放介質(zhì)。采用HPLC法測定釋放樣品中的和厚樸酚濃度，以和厚樸酚的DMSO溶液作為對照。結(jié)果和厚樸酚DMSO溶液體外釋放快且釋放完全，說明透析袋對和厚樸酚吸附較少，可以用來評價(jià)和厚樸酚脂質(zhì)體的體外釋放行為。和厚樸酚脂質(zhì)體無明顯突釋現(xiàn)象，呈現(xiàn)出緩慢釋放，尤其是24 h幾乎接近零級釋放。所以和厚樸酚脂質(zhì)體不僅可以改善和厚樸酚穩(wěn)定性和溶解性能，還具有緩控釋性能，為開發(fā)和厚樸酚的緩控釋制劑提供一定的借鑒作用。

3 討論

脂質(zhì)體制備過程中常常遇到包封率不高等問題，通過前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，影響脂質(zhì)體包封率的因素是多方面的。因此，本實(shí)驗(yàn)我們選取部分重要影響因素，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，優(yōu)化出高包封率的工藝和處方因素，并對優(yōu)化出來的和厚樸酚脂質(zhì)體進(jìn)行體外理化性能的表征。本實(shí)驗(yàn)制備的和厚樸酚脂質(zhì)體為普通脂質(zhì)體，如果對其表面進(jìn)行適當(dāng)修飾，可以得到預(yù)期各種功能性脂質(zhì)體。比如對磷脂進(jìn)行聚乙二醇（PEG）修飾后，可以得到長循環(huán)脂質(zhì)體；各種抗原-抗體修飾可以制備各種免疫脂質(zhì)體。這些修飾的脂質(zhì)體更能夠發(fā)揮藥物在體內(nèi)緩控釋及靶向效應(yīng)。

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