微囊藻毒素分子印跡攪拌棒涂層的研制及其吸附性能

丘秀珍， 梁 勇， 郭會(huì)時(shí)*

（1. 韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005；2. 華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州510006）

微囊藻是藍(lán)藻水華中的優(yōu)勢(shì)藻，它能產(chǎn)生一類環(huán)狀七肽結(jié)構(gòu)的微囊藻毒素（microcystins，MC），這類物質(zhì)已證實(shí)與人群中原發(fā)性肝癌有很大的關(guān)系［1］。微囊藻毒素的種類較多，目前發(fā)現(xiàn)的同分異構(gòu)體大約80 多種，以MC-LR、MC-YR 和MC-RR存在最普遍、含量最多。MC 的毒性和其結(jié)構(gòu)相關(guān)，其中MC-LR 是已知毒性最強(qiáng)、危害最大的一種淡水藻類毒素，是最強(qiáng)的肝臟腫瘤促進(jìn)劑［2］。為了確保飲用水的安全，我國(guó)《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 3838-2002）中對(duì)生活飲用地表水源地提出微囊藻毒素MC-LR 的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.001 mg／L。

目前微囊藻毒素的主要分析方法有超高效液相色譜法［2，3］和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［4，5］，但這些方法使用之前都需要復(fù)雜的樣品前處理。分子印跡-攪拌棒吸附萃取技術(shù)（molecularly imprinted polymers-stir bar sorptive extraction，MIPs-SBSE）是近年來(lái)發(fā)展較快的一種新型前處理技術(shù)，因具備高選擇性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便和耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于痕量有機(jī)物的富集，Li 課題組［6-9］對(duì)此也作了大量的研究報(bào)道。但從目前發(fā)展水平來(lái)看，分子印跡攪拌棒技術(shù)仍存在一些不足，如大部分印跡涂層采用傳統(tǒng)聚合方法，攪拌棒涂層形狀、厚薄不均，吸附能力較弱，印跡效率不高；MIPs 涂層太厚，嚴(yán)重影響目標(biāo)化合物的傳質(zhì)速度，在固相萃取應(yīng)用中，導(dǎo)致模板分子的“泄漏”。這些不足都大大降低了攪拌棒檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，限制了其應(yīng)用與發(fā)展。

本研究通過(guò)可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（reversible addition fragmentation chain transfer，RAFT）自由基聚合法，在凹凸棒土表面聚合制備了磁性分子印跡聚合物；并將印跡聚合物作為涂層介質(zhì)，通過(guò)溶膠-凝膠法制作攪拌棒，用于富集水體中痕量的微囊藻毒素。在RAFT 反應(yīng)中，通常加入雙硫酯衍生物作為鏈轉(zhuǎn)移試劑，同時(shí)加入其他引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈。在聚合中鏈轉(zhuǎn)移試劑與增長(zhǎng)鏈自由基形成休眠的中間體，該中間體可自身裂解，釋放出新的活性自由基，結(jié)合單體形成增長(zhǎng)鏈，雙硫酯衍生物在活性與休眠自由基之間迅速轉(zhuǎn)移，限制了增長(zhǎng)鏈自由基之間的不可逆雙基終止副反應(yīng)，使聚合反應(yīng)得以有效控制［10］。由于RAFT 聚合具有活性／可控的特點(diǎn)，因此可以通過(guò)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，控制分子印跡聚合物在基體表面的生長(zhǎng)。利用RAFT 自由基聚合法合成分子印跡材料，既可通過(guò)合成較厚的分子印跡聚合物膜以獲得較高的吸附容量，也可以通過(guò)合成較薄的分子印跡聚合物膜以獲得較好的吸附效率［10］，目前已成為分子印跡合成的研究熱點(diǎn)［10-12］。本文采用RAFT 自由基聚合法成功合成了微囊藻毒素分子印跡聚合物，并將其作為攪拌棒涂層成功用于微囊藻毒素的分離富集。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 高效液相色譜儀，配光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器（日本島津公司）；DZF-6050D 真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀FTIR-8400S （日本島津公司）；透射電子顯微鏡（TEC，JEOLIEM-200CX，日本）。

微囊藻毒素-LR、微囊藻毒素-RR 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，Sigma 公司）；三氯化鐵，氯化亞鐵，凹凸棒土（ATP），4-（氯甲基）苯基三氯硅烷，三乙胺，甲苯，苯基溴化鎂（1 mol／L，四氫呋喃為溶劑），超干四氫呋喃，二硫化碳，二甲基亞砜，甲基丙烯酸（MAA），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDNA），偶氮二異丁腈（AIBN），十二烷基硫酸鈉（SDS），丙酮，氯仿，乙酸，氨水，以上試劑未注明純度的均為分析純；乙腈，甲醇（色譜純）；超純水。

1.2 磁性分子印跡材料的制備

1.2.1 凹凸棒土磁性復(fù)合材料（ATP＠Fe3O4）的制備

參照文獻(xiàn)［13］采用改進(jìn)的共沉淀法合成ATP＠Fe3O4磁性復(fù)合材料。具體步驟如下:稱取4.72 g FeCl3·6H2O 和2.1 g 活化的ATP 粉末加入到180 mL 蒸餾水中，超聲分散30 min 后，繼續(xù)攪拌3.0 h，獲得穩(wěn)定的懸浮液。接著在N2保護(hù)和劇烈攪拌下加入1.72 g FeCl2·4H2O。隨后在80 ℃油浴下逐滴加入10 mL 氨水（25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)），并持續(xù)反應(yīng)30 min。產(chǎn)物用永磁鐵分離，用水清洗后置于真空干燥箱中干燥。

1.2.2 ATP＠Fe3O4表面RAFT 鏈轉(zhuǎn)移劑的制備

制備方法參考文獻(xiàn)［12］，取1.2 g 干燥的ATP＠Fe3O4分散于20 mL 甲苯中，加入1.30 mL 4-（氯甲基）苯基三氯硅烷，6 mL 15% （v／v）的三乙胺甲苯溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后離心分離沉淀，沉淀用乙醇洗滌多次，60 ℃真空干燥，即得到表面芐基化的磁性凹凸棒土（ATP＠ Fe3O4-Cl）。將6 mL 苯基溴化鎂分散于10 mL 超干四氫呋喃中，在50 ℃油浴下逐滴加入800 μL 干燥CS2，反應(yīng)1 h 后加入200 mg ATP＠Fe3O4-Cl，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于50 ℃油浴反應(yīng)6 h。產(chǎn)物用磁鐵分離，依次用甲醇、丙酮洗滌，60 ℃真空干燥，得到RAFT 鏈轉(zhuǎn)移劑化的磁性凹凸棒土（ATP＠Fe3O4-RAFT）。

1.2.3 凹凸棒土表面引發(fā)RAFT 法制備MC-LR分子印跡聚合物

稱取30 μg MC-LR 分散于8 mL 二甲基亞砜中，依次加入6 mmol MAA、25 mmol EGDNA、70 mg ATP＠ Fe3O4-RAFT、0.05 mg AIBN，分散均勻后通氮除氧10 min，55 ℃油浴反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵分離沉淀，沉淀依次用氯仿、甲醇-乙酸（9∶1，v／v）洗滌，60 ℃真空干燥過(guò)夜。非分子印跡聚合物（NIPs）的制備方法除不加MC-LR 外與分子印跡聚合物的制備方法相同。

1.3 分子印跡攪拌棒涂層的制備

攪拌棒的制作過(guò)程參照文獻(xiàn)［9］，在玻璃棒（30 mm×2.5 mm）內(nèi)放入一鐵芯，兩端封死，作為涂漬的載體，玻璃棒在涂漬前依次用NaOH 和HCl 浸泡6 h，用水洗凈后置于真空干燥箱內(nèi)干燥備用。將30 mg MIPs 磁性微球分散在900 μL 的甲苯中，依次加入150 μL 甲基三甲氧基硅烷、450 μL 含氫硅油和900 mg 聚二甲基硅氧烷，充分混勻后，加入240 μL的三氟乙酸，立刻渦旋2 h，直至溶液變?yōu)榫鶆虻娜榘咨z液。然后，將活化好的玻璃棒插入膠液中，30 min 后將其取出，用氮?dú)獯蹈珊螅俅谓](méi)在膠液中，如此反復(fù)涂層5 ～6 次。最后，將涂層好的玻璃棒置于真空干燥箱中，室溫下老化干燥12 h。依上述操作用NIPs 代替MIPs，制得NIPs 攪拌棒。

1.4 MIPs-SBSE 的萃取性能研究

準(zhǔn)確量取5 mL 20 μg／L MC-LR 溶液，置于圓底燒瓶中，分別放入MIPs 和NIPs 攪拌棒，在室溫下振蕩（200 r／min）吸附。5 h 后，將攪拌棒取出，置于5 mL 甲醇-乙酸（9∶1，v／v）混合溶劑中解吸，解吸液吹干后，加入150 μL 甲醇復(fù)溶，溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC 測(cè)定，計(jì)算吸附量。以MCRR 為競(jìng)爭(zhēng)底物，考察MIPs 涂層對(duì)MC-LR 的選擇性。

1.5 色譜分析條件

色譜柱:Inertstil （ODS-SP）（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm；流動(dòng)相:乙腈-水（50∶50，v／v）；流速:1.0 mL／min。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的表征

2.1.1 透射電鏡圖

ATP＠ Fe3O4復(fù)合材料和ATP＠ Fe3O4-MIPs的透射電鏡圖見(jiàn)圖1，從ATP＠Fe3O4-MIPs 電鏡圖中可以看出，制備的凹凸棒土磁性微球表面有明顯的聚合物涂層，這說(shuō)明其表面已成功聚合MIPs。

2.1.2 紅外光譜分析

圖2 為ATP＠Fe3O4-MIPs 制備過(guò)程中各步驟產(chǎn)物的紅外光譜圖。

圖1 （a）ATP＠Fe3O4 和（b）ATP＠Fe3O4-MIPs的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 Transmission electron microscopy （TEM）images of （a）ATP＠Fe3O4 and （b）ATP＠Fe3O4-MIPs

圖2 樣品的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra for samples

在ATP＠Fe3O4的紅外光譜圖（圖2a）中，1 010 cm-1為Si-O-Si 的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，3 450 cm-1為Si-O-H 的伸縮振動(dòng)峰。ATP＠Fe3O4-Cl 的紅外光譜圖（圖2d）中，1 645 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)骨架-C＝C-的伸縮振動(dòng)吸收峰；910 cm-1處出現(xiàn)了C-Cl 的振動(dòng)吸收峰。這表明球形硅膠表面的硅羥基和硅烷試劑之間發(fā)生縮合反應(yīng)，將4-（氯甲基）苯基三氯硅烷試劑接枝到ATP 表面。ATP＠ Fe3O4-RAFT 的紅外光譜圖（圖2b）中，1 100 cm-1附近-C ＝S 伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)，1 645 cm-1處苯環(huán)骨架-C ＝C-伸縮振動(dòng)吸收峰增強(qiáng)，說(shuō)明硅膠表面成功負(fù)載了RAFT試劑。ATP＠Fe3O4-MIPs 微球的紅外光譜圖（圖2c）中，1 700 cm-1附近吸收峰明顯增強(qiáng)，歸屬于功能單體MAA 和交聯(lián)劑EGDMA 中的-C ＝O 伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明在球形硅膠表面成功合成了MIPs。

2.2 MIPs-SBSE 萃取條件的優(yōu)化

2.2.1 攪拌棒的穩(wěn)定性考察

為了考察涂層的熱穩(wěn)定性，我們將MIPs 和NIPs 攪拌棒置于真空干燥箱里，依次在25、40、60℃下加熱6 h。結(jié)果表明，在這3 種溫度下攪拌棒均無(wú)明顯變化，說(shuō)明MIPs 和NIPs 在該溫度范圍內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性。此外，為考察涂層的耐溶劑性，我們分別嘗試用超純水、甲醇、乙醇、甲苯浸泡攪拌棒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MIPs 和NIPs 涂層經(jīng)純水、甲醇、乙醇室溫下浸泡12 h 后，涂層完好，外觀未見(jiàn)有損壞，且吸附試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有明顯的改變；而在甲苯中浸泡12 h 后，可見(jiàn)涂層變?yōu)橥该髂z狀，且明顯發(fā)生脫落，這可能是聚二甲基硅氧烷在非極性溶劑中的溶脹作用引起的。這表明MIPs 涂層適合在強(qiáng)極性溶劑中吸附萃取，滿足吸附萃取水體中微囊藻毒素的要求。

2.2.2 萃取時(shí)間的選擇

按1.4 節(jié)實(shí)驗(yàn)方法，我們考察了萃取時(shí)間為1～12 h 時(shí)，MIPs 和NIPs 攪拌棒涂層對(duì)MC-LR 的吸附量，結(jié)果如圖3。由圖3 可知，MIPs 和NIPs 涂層對(duì)MC-LR 的吸附量在0 ～3 h 之內(nèi)增加較快，3 h后增加較為緩慢，5 h 后達(dá)到吸附平衡，且MIPs 涂層吸附量明顯高于NIPs。故本實(shí)驗(yàn)選擇攪拌吸附時(shí)間為5 h。

圖3 MIPs 和NIPs 涂層攪拌棒的吸附量Fig.3 Extraction amounts of MIPs coated and NIPs coated stir bars

2.2.3 解吸溶劑和解吸時(shí)間的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了用甲醇、乙腈、甲醇-乙酸（9∶1，v／v）和乙腈-乙酸（9∶1，v／v）作解吸溶劑，攪拌棒涂層吸附萃取20 mg／L MC-LR 的萃取率，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，甲醇解吸體系的解吸效果稍強(qiáng)于乙腈解吸體系。原因可能是甲醇屬于質(zhì)子型的極性溶劑，其破壞目標(biāo)物與攪拌棒涂層氫鍵作用力的能力要強(qiáng)于乙腈分子。在甲醇中加入10% （v／v）乙酸，萃取率略有增加，因此，本研究選擇甲醇-乙酸（9∶1，v／v）作為解吸溶劑。實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了解吸時(shí)間為10 ～90 min 時(shí)，MIPs 和NIPs 涂層對(duì)MC-LR 的萃取率。結(jié)果表明解吸時(shí)間在30 min 前，萃取率逐漸增大，30 min 后萃取率變化趨于平緩。說(shuō)明涂層吸附的MCLR 在30 min 基本解吸完全。故選擇30 min 為解吸時(shí)間。

2.3 MIPs-SBSE 的選擇性能研究

在自然界含量最多的3 種MC 同分異構(gòu)體中，MC-LR 的急性毒性最強(qiáng)，MC-YR 次之，MC-RR最弱。目前，國(guó)內(nèi)外研究最多的主要是MC-LR 和MC-RR，故本研究也以這兩種物質(zhì)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)選擇性試驗(yàn)。配制相同濃度的MC-LR 與MC-RR 標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最佳萃取條件下，分別用MIPs-SBSE 和NIPs-SBSE 萃取，計(jì)算回收率（見(jiàn)圖4）。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，MIPs 攪拌棒對(duì)MC 的回收率明顯高于NIPs 攪拌棒，且MIPs 攪拌棒對(duì)MC-LR 的萃取回收率高于MC-RR，說(shuō)明MIPs 攪拌棒對(duì)MC 具有良好的選擇性，對(duì)模板分子MC-LR 選擇性更佳。

圖4 MIPs 和NIPs 攪拌棒對(duì)MC-LR 的選擇性吸附Fig.4 Selective adsorption of MC-LR MIPs and NIPs coated stir bars

2.4 攪拌棒重復(fù)利用性能研究

取飽和吸附MC-LR 的MIPs 攪拌棒，以5 mL甲醇和乙酸的混合溶液（90∶10，v／v）為解吸溶劑，攪拌解吸30 min，使MC-LR 從MIPs 涂層上洗脫下來(lái)。再按以上方法進(jìn)行5 次吸附-解吸附過(guò)程。計(jì)算MIPs 攪拌棒涂層對(duì)MC-LR 5 次再生的吸附容量。研究發(fā)現(xiàn)，5 次再生后，MIPs 攪拌棒涂層對(duì)MC-LR 的吸附容量?jī)H降低了5.7%，表明攪拌棒涂層具有良好的重復(fù)利用性能。

2.5 方法的可行性和實(shí)際應(yīng)用

我們將MIPs 攪拌棒吸附萃取與HPLC-PDA 聯(lián)用，用外標(biāo)法測(cè)定了飲用水體中的MC-LR，該方法在0.010 ～5.0 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2＞0.997，檢出限為0.27 μg／L （S／N ＝3）。我們用該方法測(cè)定了廣東韶關(guān)居民飲用水源區(qū)水體中的微囊藻毒素MC-LR。直接用飲用水進(jìn)樣，色譜圖中檢測(cè)不到MC 的色譜峰；飲用水經(jīng)MIPs-SBSE 富集后進(jìn)樣，MC-LR 和MC-RR 可以被檢出（見(jiàn)圖5），富集倍數(shù)分別為17.6 和8.2，說(shuō)明MIPs-SBSE 對(duì)MC具有較好的富集效果。同時(shí)我們還做了樣品加標(biāo)試驗(yàn)，飲用水中MC-LR 添加水平為20、40、80 μg／L時(shí)，加標(biāo)回收率范圍為83.33% ～100.07%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n ＝3）為1.40% ～9.17%（見(jiàn)表1），結(jié)果滿足痕量分析的要求。

圖5 富集后實(shí)際樣品的色譜圖Fig.5 Chromatogram of a real sample after enrichment

表1 水樣加標(biāo)回收率與精密度（n ＝3）Table 1 Recoveries and RSDs of the analytes spiked in water samples （n ＝3）

3 結(jié)論

我們采用RAFT 聚合法利用ATP＠Fe3O4制備了MC-LR 磁性分子印跡微球，并通過(guò)溶膠-凝膠法，將合成的印跡微球分散在合成的乳白色膠液中，將攪拌棒插入其中制得分子印跡攪拌棒。在優(yōu)化的萃取條件下，分子印跡攪拌棒顯示出了較好的選擇吸附性能，MIPs 攪拌棒對(duì)MC 的吸附能力也明顯優(yōu)于NIPs 攪拌棒。同時(shí)我們建立了MIPs-SBSEHPLC 聯(lián)用檢測(cè)飲用水中痕量微囊藻毒素的新方法，該方法的富集倍數(shù)高，方法檢出限低至0.27 μg／L，顯示了較高的靈敏度。最后，我們應(yīng)用該方法成功檢測(cè)了水源區(qū)水體中的MC-LR，結(jié)果令人滿意。

致謝:感謝韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院盧文貫教授為本論文的測(cè)試工作提供的幫助。

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