牧草分子遺傳連鎖圖譜及其應(yīng)用

謝文剛，劉文獻，張建全，王彥榮

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州730020）

牧草，廣義上泛指可用于飼喂家畜的草類植物，包括草本、藤本、小灌木、半灌木和灌木等各類栽培或野生植物；狹義上僅指可供栽培的飼用草本植物，尤指豆科牧草和禾本科牧草［1］。牧草是農(nóng)業(yè)自然資源的重要組成部分，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要生產(chǎn)資料，也是發(fā)展草地畜牧業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的牧草新品種，充分發(fā)揮其在改良退化農(nóng)田、恢復(fù)草地功能、調(diào)整農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)、固碳減排、建立草地農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中不可替代的作用，是保障國家食物安全和生態(tài)安全的重要措施之一。

遺傳連鎖圖譜是指通過遺傳重組分析得到的基因或?qū)Ｒ坏亩鄳B(tài)性遺傳標記在染色體上的線性排列順序 圖［2］。目前包括玉米（Zeamays）［3］、水稻（Oryzasativa）［4］、小麥（Triticumaestivum）［5］等主要農(nóng)作物均已構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并被廣泛應(yīng)用于數(shù)量性狀位點（QTL）定位［6］、比較基因組［7-8］和分子標記輔助育種［9-10］等領(lǐng)域以改良植物的重要農(nóng)藝性狀，大幅度提高植物的育種水平和育種效率。和大多數(shù)農(nóng)作物相似，牧草許多重要的農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性等一般為數(shù)量性狀，受微效多基因控制。牧草常規(guī)育種周期長，效率低，而利用DNA分子標記構(gòu)建牧草遺傳圖譜，開展QTL定位研究及分子標記輔助育種，加快培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗牧草新品種已成為目前牧草育種工作中的一個重要發(fā)展方向。本文就牧草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及應(yīng)用的研究現(xiàn)狀和最新成果進行了概述，以期為牧草分子育種的進一步發(fā)展提供參考。

1 牧草遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建研究現(xiàn)狀

1.1 已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜

與多數(shù)一年生模式植物相比，牧草多為多年生、異交的多倍體植物，如紫花苜蓿、白三葉、鴨茅等同源四倍體，而羊草（Leymuschinensis）為異源四倍體，遺傳背景相對復(fù)雜，異交多倍體牧草存在分離基因型眾多、不同DNA片段共分離，雜交后代常表現(xiàn)為四體遺傳等特點，造成其在遺傳分析上存在較多困難。但隨著“擬測交”策略的應(yīng)用［11］及各種分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前已構(gòu)建了20余個草種近40張遺傳連鎖圖譜（表1）。所構(gòu)圖譜主要涉及豆科的苜蓿屬（特別是紫花苜蓿）［12-18］、三葉草屬［19-21］、百脈根［22-23］，禾本科的羊茅屬［24-26］、黑麥草屬［27-34］和鴨茅屬［35-37］等常見草種。

1.2 作圖群體

構(gòu)圖群體親本的選擇是群體構(gòu)建成功及圖譜質(zhì)量高低的決定因素之一，最大限度地選擇親本間性狀差異與親和性的統(tǒng)一是親本選擇的基本原則［2］。常見的遺傳連鎖圖譜的群體有：臨時性群體如F2及其衍生的F3、F4家系和回交群體（BC）。永久性分離群體，如回交自交系群體（BIL）、重組自交系群體（RIL）、雙單倍體群體（DH）、近等基因系群體。對于親本基因型高度雜合的植物，也可采用“雙擬測交”（Double-pseudo-testcross）的方法建立F1分離群體［11］?！半p擬測交”是指兩個親本基因型均為雜合，互為測交群體，與測交試驗一樣，后代基因型的分離比例為1∶1，但兩個親本都非純合隱性，所以稱為擬測交。由于大多數(shù)牧草具有多年生、異花授粉和自交不親和等特性，使培育純系較為困難，難以構(gòu)建BC1等群體，因此，目前大部分牧草分子連鎖圖譜大部分是利用“雙擬測交”F1作圖群體構(gòu)建的，如多年生黑麥草［28-30］、多花黑麥草［32-33］、草地羊茅［26］、鴨茅［35-37］和賴草［38］等。對于自交衰退不嚴重的異交草種，也可仿照一年生農(nóng)作物創(chuàng)建自交純系進行雜交以獲得F2群體或BC1群體進行遺傳作圖，如結(jié)縷草（Zopsiaspp.）［41］、紫花苜蓿［12，14，16］等。

另外，作圖群體的大小也是影響圖譜品質(zhì)的重要因素。一般而言，大的作圖群體包含更多的基因重組個體，在遺傳作圖時能獲得更多的分離標記，使所構(gòu)圖譜更飽滿，基因組覆蓋更全面。如 Mott等［39］利用含387個后代的回交群體，構(gòu)建了含515個分子標記，圖幅長度為2 574cM的遺傳圖譜，標記間的平均距離為4.9cM。

1.3 作圖標記

DNA分子標記直接反映植物分子水平上的遺傳多態(tài)性，因其簡單、快捷、受環(huán)境影響小和可重復(fù)性強等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于牧草遺傳圖譜構(gòu)建研究中。目前，用于植物遺傳作圖的主要分子標記有RFLP、RAPD、AFLP、SRAP和SSR等。

對于大多數(shù)牧草物種而言，親本是高度雜合的個體，從親本到子代需要傳遞多個等位基因，RAPD等顯性標記往往難以區(qū)分純合基因型或雜合基因型，而SSR等共顯性標記能夠檢測多個等位位點，獲得異交親本中最大量的多態(tài)性。早期構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜主要利用的分子標記是RFLP和AFLP等。RFLP標記具有重復(fù)性好和共顯性的特點，在構(gòu)建牧草核心或框架圖譜，特別是比較作圖中有重要作用。如Xu等［24］利用RFLP標記構(gòu)建了高羊茅的遺傳圖譜，構(gòu)圖群體中有105個子代，圖譜長度達1 274cM，分布在19個連鎖群。該標記也被用在紫花苜蓿［12-14，16］、多年生黑麥草［28，30，32］等草種的遺傳圖譜構(gòu)建上。AFLP技術(shù)耗時量小，信息量大，是構(gòu)建高精密度分子遺傳圖譜的重要標記。如Sandal等［23］在日本百脈根的研究中利用AFLP所構(gòu)建的圖譜中圖幅的平均距離已小到0.6cM。SSR標記由于具有共顯性、基因組中分布廣泛、重復(fù)性好、多態(tài)性高、信息量大等優(yōu)點，避免了RFLP方法中使用放射性同位素的缺點，又比RAPD重復(fù)率和可信度高，在遺傳圖譜構(gòu)建方面具有廣闊的研究前景，是理想的標記之一，已應(yīng)用于紫花苜蓿［17］、紅三葉［20］、高羊茅［25］、黑麥草［27，29］、鴨茅［35-37］、賴草［38］、結(jié)縷草［42，44］等草種的遺傳圖譜構(gòu)建。隨著高通量測序等技術(shù)的發(fā)展，單核苷酸多態(tài)性標記（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）、序列標簽位點（Sequence tag Site，STS）標記［39］及多樣性微陣列技術(shù)（Diversity Arrays Techenology，DArT）［31］等新型標記也將在遺傳作圖中顯示出廣泛的應(yīng)用前景。

表1 牧草遺傳圖譜構(gòu)建研究進展Table 1 Genetic linkage maps in forage grasses

續(xù)表1

2 牧草遺傳連鎖圖譜的應(yīng)用

對于牧草育種者而言，牧草大多數(shù)的性狀如干物質(zhì)產(chǎn)量、牧草品質(zhì)和非生物抗性等常表現(xiàn)出連續(xù)的表型變異，并受多個數(shù)量性狀位點控制。以往育種者主要是通過多年輪回選擇對目標性狀進行改良，育種周期長，效率低。分子遺傳連鎖圖譜則有助于在分子層面分析與主要農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的基因區(qū)域或分子標記，從而定位和克隆重要的農(nóng)藝性狀基因、檢測和標記數(shù)量性狀位點，并應(yīng)用于分子標記輔助育種，可大幅度提高牧草育種的水平和效率。

2.1 牧草重要農(nóng)藝性狀QTL定位

隨著分子標記技術(shù)和分子連鎖圖譜構(gòu)建的迅猛發(fā)展，使得數(shù)量性狀位點（QTL）定位成為可能。目前國外已有大量的牧草QTL研究的報道（表2），主要集中在黑麥草屬［27，50-70］、賴草屬［73-77］和苜蓿屬［78-84］等。我國牧草QTL研究的報道相對較少，僅見于鴨茅［37］、高丹草［40］、結(jié)縷草［90］等少數(shù)草種。在牧草QTL研究領(lǐng)域，黑麥草屬Q(mào)TL研究最為廣泛和深入，研究內(nèi)容涉及多個主要的農(nóng)藝性狀，如抗病性［50-56］、開花期［60-63］、種子產(chǎn)量相關(guān)性狀［58］、牧草品質(zhì)相關(guān)性狀［64-65］、牧草產(chǎn)量相關(guān)性狀［67］等。

2.1.1 抗病QTL定位 牧草抗病QTL研究主要集中在黑麥草屬上，包括抗銹病、細菌性萎蔫病、霉粉病和葉斑病等。Studer等［27］用含307單株的“雙擬測交”群體為材料對多花黑麥草冠銹病QTL進行了研究，在第1和2連鎖群上檢測到抗冠銹病相關(guān)QTL，它們能解釋高達56%的表型變異。在多年生黑麥草第1和2連鎖群上也發(fā)現(xiàn)了4個冠銹病QTLs，其中LpPc4和LpPc2位于第1連鎖群，Lp-Pc3和LpPc1位于第2個連鎖群上，它們分別能解釋12.5%、24.9%、5.5%和2.6%的表型變異，比較作圖分析發(fā)現(xiàn)，這些QTL所在連鎖群與燕麥A和B染色體具有同源性，在燕麥A和B染色體上已經(jīng)鑒定了抗冠銹病相關(guān)基因［52］。Pfender等［54］也在第1、6和7連鎖群上共檢測到3個抗桿銹病QTL（qLpPg1、qLpPg2、qLpPg3），其中主效 QTL（qLpPg1）定位在第7連鎖群上，可解釋30%～38%的表型變異。

2.1.2 產(chǎn)量相關(guān)QTL定位 提高牧草單位面積草產(chǎn)量或種子產(chǎn)量是牧草的主要育種目標，其中種子產(chǎn)量對牧草品種的生產(chǎn)、推廣和應(yīng)用有重要影響。Espinoza等［84］利用蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）4個作圖群體研究了主枝長度（LPB）、分枝延伸率（BER）、干物質(zhì)（ADM）、主莖干長（LMS）等產(chǎn)量相關(guān)性狀，通過對單個和多個群體的分析表明，主要的QTL區(qū)域位于第1、2、7和8染色體上，多群體分析揭示了3個與LPB、LMS、BER等性狀密切相關(guān)的主效的QTL區(qū)域。Studer等［58］利用F2作圖群體，構(gòu)建了黑麥草遺傳連鎖圖譜，在連鎖群1和2上檢測到兩個與種子產(chǎn)量相關(guān)的QTL，它們分別解釋了41%和18%的表型變異。Faville等［67］在多年生黑麥草連鎖群1、2、4和6上檢測到與草產(chǎn)量有關(guān)的QTL。Herrmann等［86］檢測到38個與紅三葉種子產(chǎn)量性狀相關(guān)（每株植物的種子數(shù)、每個花序上的種子產(chǎn)量、每株植物上的花序數(shù)等）的QTL，這為紅三葉種子產(chǎn)量性狀的改良和分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。Robins和Brammer［80］利用紫花苜蓿F1群體對影響牧草產(chǎn)量、株高、再生性等產(chǎn)量相關(guān)性狀進行了QTL分析，分別在連鎖群3、4、5和7上檢測到影響這些性狀的QTL位點，它們解釋的表型變異在11%～44%。

表2 牧草主要農(nóng)藝性狀QTLTable 2 QTL for important agronomic trait in forage grasses

2.1.3 牧草品質(zhì)相關(guān)QTL定位 Espinoza和Julier［83］利用蒺藜苜蓿作圖群體研究了粗蛋白、消化率等品質(zhì)相關(guān)的QTL，主效QTL主要分布于染色體1、3、7和8的4個基因區(qū)域，其中牧草品質(zhì)相關(guān)的QTL和形態(tài)QTL定位在相同的區(qū)域，由此推測品質(zhì)性狀和表型特征具有緊密的關(guān)系，該研究為進一步鑒定和挖掘豆科牧草品質(zhì)相關(guān)的基因奠定了基礎(chǔ)。Cogan等［64］對黑麥草牧草品質(zhì)（如粗蛋白、體外消化率、中性洗滌纖維等）的QTL進行了分析，在連鎖群3、5、7上共檢測到42個影響這些性狀的QTL位點，其中LG3包含了影響所觀測性狀的所有QTL位點，LG7上包含了除粗蛋白外的所有QTL位點。研究指出，與這些位點緊密連鎖的分子標記，對于分子標記輔助育種有重要利用價值。碳水化合物含量（WSC）是決定牧草品質(zhì)的一個重要因素，對該性狀進行分子標記輔助選擇對于黑麥草分子育種及目標性狀的改良意義重大。Turner等［65］檢測到影響黑麥草 WSC含量的QTL，同時利用與WSC含量QTL緊密連鎖的標記去測試這些QTL的效應(yīng)，雖然WSC含量和其他因素有復(fù)雜的相互影響，但進一步證明了這些QTL區(qū)域?qū)邴湶軼SC含量有調(diào)控作用。另外，黑麥草脂肪酸成分QTL也被定位于相應(yīng)的連鎖群上，其中棕櫚酸含量（C16：0）QTL位于連鎖群2和7、硬脂酸（C18：3n-3）位于連鎖群3、4和7、亞油酸（C18：2n-6）和亞麻酸（C18：3n-3）分別位于連鎖群2和1［69］。Larson和 Mayland［73］對賴草粗蛋白（CP）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和 Al、B、Ca、Cu等14種礦物質(zhì)含量及 K／（Ca＋Mg）比例（KRAT）等進行了分析，發(fā)現(xiàn)在作圖群體中這些性狀存在顯著的變異，并檢測到所有性狀的QTL位點，如 ADF位于 LG1a、LG5Xm、LG7a、NDF位于LG7a，Mn位于 LG2b、LG3b、LG4Xm，S位于 LG3等。研究結(jié)果對于篩選和培育新的賴草新品種，鑒定和挖掘影響礦物質(zhì)含量及纖維互作的功能基因也有重要意義。

2.1.4 抗非生物脅迫QTL定位 水澇通過影響植物根部對水分的吸收從而影響植物正常生長。Pearson等［68］利用NAx和AU6為親本構(gòu)建了F1作圖群體，在對作圖群體進行8d水澇脅迫后，測定了9個相關(guān)的數(shù)量性狀，最終檢測到37個QTL位點。其中19個QTL位點位于NAx圖譜上，18個位于AU6圖譜上。在連鎖群3和4上發(fā)現(xiàn)了黑麥草耐澇相關(guān)的特殊區(qū)域。在抗凍性和抗旱性研究方面，Alm等［71］在草地羊茅染色體5F上檢測到兩個抗凍性QTL，在染色體3F上檢測到1個抗旱性QTL。Brouwer等［79］利用紫花苜蓿為材料定位了冬季抗寒、抗凍和秋季生長性QTL，在第5和8連鎖群上發(fā)現(xiàn)了影響秋季生長，冬季抗寒、抗凍的QTL，但僅對秋季生長和抗凍性有影響的QTL定位在連鎖群1和3，這些QTL區(qū)域可用于分子標記輔助育種選擇。Sledge等［81］對二倍體紫花苜?？逛X性進行了QTL研究，發(fā)現(xiàn)兩個RFLP標記UGAc471和UGAc502與作圖F2群體的抗鋁性緊密連鎖，可用于將檢測到的QTL位點滲入到栽培的紫花苜蓿品種以提高其抗鋁性。丁成龍等［90］在人工低溫脅迫條件下研究結(jié)縷草葉片的半致死溫度（LT50）、可溶性糖、可溶性蛋白含量及過氧化物歧化酶（SOD）活性的變化，并以447個SSR標記構(gòu)建的日本結(jié)縷草遺傳連鎖圖譜為基礎(chǔ)，對抗寒相關(guān)的性狀可溶性糖、可溶性蛋白含量及SOD活性進行了QTL定位分析，分別定位到與葉片可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD活性相關(guān)的QTL各1個，分布于連鎖群10、13和17。

2.1.5 繁殖性狀相關(guān)QTL 了解植物的繁殖特性與種子生產(chǎn)性能是種質(zhì)資源的保存與更新、野生種的馴化選育和新品種推廣利用的重要前提。深入研究草類植物繁殖性狀的生物學基礎(chǔ)，培育種子產(chǎn)量高、生產(chǎn)性能好的草類新品種，是以往國內(nèi)外關(guān)注不多、但目前亟待研究的重要領(lǐng)域。草類植物的繁殖性狀，主要包括開花時間、花部形態(tài)、種子育性、種子落粒性、種子形態(tài)等。Xie等［37］在鴨茅連鎖群2、5和6檢測到與開花時間相關(guān)的7個QTL。其中LG2上的QTL定位在兩親本同源連鎖群相同區(qū)域，且都與標記Contig3046緊密連鎖，QTL分別解釋了8%和22%的表型變異。該研究所定位的QTL位置與近緣物種如黑麥草等所定位的開花QTL位置基本一致，為近一步挖掘鴨茅開花基因奠定了良好基礎(chǔ)。Larson和Kellogg［74］在賴草屬雜交種第6條染色體檢測到控制落粒性的QTL，該位點與水稻第2條染色體具有同源性。Ergon等［72］在草地羊茅染色體7F上檢測到一個影響小穗數(shù)量變異的基因區(qū)域。一個穗長QTL、3個小穗數(shù)QTL被鑒定，分別解釋了32%～33%的表型變異。并且這些QTL與抽穗期QTL基本一致，表明他們受潛在的相關(guān)基因協(xié)作調(diào)節(jié)。在連鎖群4的頂端發(fā)現(xiàn)一個區(qū)域同時包含了抽穗時間、穗長和小穗數(shù)QTL，同時這也是穗長主效QTL所在位置。

2.2 重要農(nóng)藝性狀基因定位

從目前牧草研究情況看，在黑麥草、羊茅等少數(shù)牧草上有開花基因和抗逆基因的相關(guān)報道。開花期是牧草的重要農(nóng)藝性狀，對牧草產(chǎn)量、飼用品質(zhì)及利用價值有重要影響。抽穗開花后飼草品質(zhì)往往快速下降，生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)不同需要培育不同生育期的早晚熟品種，尤其在混播草地中培育晚熟的牧草品種能大大提高草地生產(chǎn)能力和利用效率。Jensen等［63］利用多年生黑麥草品種“Veyo”和來自于“Falster”的一個基因型雜交，構(gòu)建了含184個單株的F2的作圖群體，檢測到5個影響黑麥草春化的QTL，并在第4連鎖群上主效QTL的附近成功定位了一個春花基因VRN1。Xie等［92］利用水稻、小麥、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、黑麥草等物種的開花期基因的保守序列，設(shè)計基因探針，與鴨茅基因組雜交進行目標基因的捕獲，通過測序并設(shè)計基因引物最終將Vrn3基因成功定位在鴨茅的第3個連鎖群上。Armstead等［60］在多年生黑麥草上鑒定了與水稻Hd1基因和大麥（Hordeumvulgare）HvCOl基因同源的抽穗基因LpHd1，該基因位于黑麥草第7染色體的定位區(qū)域。Tamura和Yamada［93］定位了多年生黑麥草的CBF基因簇，4個CBF基因（LpCBFIb，LpCBFII，LpCBFIIIb和LpCBIIIc）定位在連鎖群5上，另一個基因LpCBFVb定位于連鎖群1上。

2.3 比較基因組分析

比較作圖就是利用共同的遺傳標記（主要是分子標記、基因的cDNA克隆以及基因組克?。ο嚓P(guān)物種進行物理或遺傳作圖，比較這些標記在不同物種基因組的分布情況，揭示染色體片段上的同線性（Synteny）或共線性（Collinearity），從而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進化歷程進行準確分析［94］。比較作圖的分子基礎(chǔ)是物種間DNA序列尤其是編碼序列的保守性。植物的比較作圖最早是在番茄（Lycopersiconesculentum）和馬鈴薯（Solanum tuberosum）［95］、番茄和胡椒（Pipernigrum）［96］之間進行的。近年來，比較作圖在禾本科作物分子作圖上迅速發(fā)展。通過黑麥（Secalecereale）、玉米、小麥和水稻［97］、玉米和高粱（Sorghumbicolor）等［98］的比較基因組研究表明，雖然這些物種在遺傳背景、染色體組成、基因組大小存在差異，但比較作圖結(jié)果表明：許多標記在不同作物的遺傳圖譜上的位置和順序都具有高度的保守性，說明染色體間共線性片段和基因組的同源性在不同物種間廣泛存在。開展牧草與作物間的比較基因作圖研究，對于在基因組研究較少的牧草物種中發(fā)現(xiàn)重要的農(nóng)藝性狀基因，開展功能分析具有重要意義。

比較基因作圖和微線性分析表明，黑麥草抽穗基因LpHd1和草地羊茅抽穗基因FpHd1是水稻Hd1基因的同源基因。表明LpHd1和FpHd1基因預(yù)測的蛋白質(zhì)序列是類似CONSTANS基因鋅指蛋白，它們與水稻Hd1的序列同源性分別為61%～62%，而與大麥HvCOl的序列同源性為72%。同時LpHd1基因在黑麥草第7染色體的定位區(qū)域，與水稻Hd1基因所在的第6染色體和大麥HvCOl基因所在的第7H染色體的基因組間具有一定的共線性［60］。此外，多花黑麥草抽穗期的主效QTL與水稻抽穗期基因Hd3位點具有共線性關(guān)系［62］。而黑麥草上已發(fā)現(xiàn)3個與春化反應(yīng)相關(guān)的候選基因，DNA序列比對表明它們與二倍體小麥的TmVRN2基因及水稻的Hd1基因具有高度的同源性［99］。Alm等［71］對草地羊茅抗凍性和抗旱性 QTL進行了定位，通過將草地羊茅兩個抗凍QTL小麥相關(guān)QTL進行比較分析發(fā)現(xiàn)，羊茅染色體5F上的兩個抗凍QTL與小麥同源連鎖群5A上的Fr-A1和Fr-A2具有較高同源性，草地羊茅3F上的抗旱性QTL與水稻染色體上相應(yīng)的抗旱位點具有線性關(guān)系。對鴨茅EST序列和黑麥草EST序列的同源比對發(fā)現(xiàn)：鴨茅連鎖圖譜上的8個SSR標記與黑麥草連鎖圖譜上的標記具有同源性。其中，鴨茅連鎖群1、2、3、4的部分SSR標記與黑麥草相同連鎖群上的標記序列具有同源性。而鴨茅連鎖群5的SSR標記與黑麥草第7連鎖群的EST序列具有同源性［37］。

3 牧草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建存在問題及展望

遺傳圖譜的構(gòu)建開創(chuàng)了牧草分子遺傳育種的新局面，但現(xiàn)階段直接用于牧草的育種實踐還有很大的距離。主要表現(xiàn)在以下方面：

（1）作圖標記以隨機標記為主，共顯性標記利用有限。目前，一半以上牧草連鎖圖譜是用RAPD和AFLP等顯性標記構(gòu)建而成的。雖然利用這些隨機標記可獲得大量分離位點，快速構(gòu)建連鎖圖譜，但它們無法準確區(qū)分純合子和雜合子，且這些標記擴增的片段通常是非編碼區(qū)域，難以直接用于分離控制重要農(nóng)藝性狀的基因，造成在牧草分子育種及目標性狀改良上有很大的局限性，極大地降低了遺傳圖譜的應(yīng)用價值。因此，在遺傳標記選擇上，應(yīng)多選用SSR、EST-SSR等共顯性標記，同時利用近緣物種上成功構(gòu)圖且與重要農(nóng)藝性狀基因或QTL連鎖的標記聯(lián)合作圖，以大大提高圖譜的飽和度，同時利于更準確地進行QTL分析及開展不同物種間比較作圖分析。

（2）牧草遺傳圖譜構(gòu)圖群體選擇和群體大小。為保證連鎖圖譜的準確性，每個群體應(yīng)保證有足夠的個體，而構(gòu)建骨架連鎖圖可基于大群體中的一個隨機小群體（如150個單株或家系）［100］。在已構(gòu)建的牧草連鎖圖譜中構(gòu)圖群體大小從幾十到幾百不等，僅有紅三葉［19］、日本百脈根［23］、多年生黑麥草［30］、鴨茅［37］、賴草［38］和冰草［39］等草種的部分作圖群體大于150個單株。但幾乎所有的構(gòu)圖群體是F1、F2暫時性分離群體，雖然這些群體構(gòu)建時間短、成本低、信息量大，但難以較長期保存，研究結(jié)果的可比性不強，不利于信息的共享。在今后的工作中應(yīng)加強多子代永久群體的構(gòu)建和保存研究，發(fā)展基于更大的作圖群體下建立起來的植物遺傳連鎖圖譜。

（3）構(gòu)建的牧草連鎖圖譜大多密度偏低，且均勻性較差，難以滿足基因定位、克隆和分子輔助選擇育種的要求。已構(gòu)建的牧草連鎖圖譜大多是框架圖譜，連鎖群數(shù)與研究對象實際染色體數(shù)或多或少存在差異，不同構(gòu)圖群體和不同親本間的連鎖群有時也不同；大多數(shù)已構(gòu)建的牧草圖譜的圖幅較小，標記間的間隙較大，還不能滿足QTL分析、基因克隆和分子標記輔助選擇對遺傳圖譜的要求。加強準確、完整、實用和高密度遺傳圖譜的構(gòu)建研究十分必要。

總之，植物遺傳連鎖圖譜的發(fā)展趨勢是高飽和化、實用化和通用化。隨著人們對牧草重要性認識的不斷提高及分子生物學技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，牧草遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的研究必將邁上一個新的臺階。在此基礎(chǔ)上結(jié)合牧草育種的主要目標開展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等重要農(nóng)藝性狀QTL定位研究，挖掘和克隆一批重要的功能基因，以改良牧草重要的農(nóng)藝性狀，加快牧草育種進程，是牧草育種的必由之路。

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