HPLC法測定中風(fēng)通絡(luò)丸中丹參酮ⅡA和丹酚酸B的含量

潘 勇，劉豐賢，鄒 輝

(1.湖南省腫瘤醫(yī)院，湖南 長沙 410000;2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410000)

腦梗死又稱為缺血性腦卒中，屬于中醫(yī)學(xué)的中風(fēng)范疇，是腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧引起的局限性腦組織缺血性壞死或腦軟化，而出現(xiàn)的相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征。今年來腦梗死的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，嚴重地威脅著人們的健康。按照中醫(yī)理論，中風(fēng)多發(fā)于“實”，歸于“虛”，根據(jù)這一發(fā)病機制，目前臨床上應(yīng)用較廣的是中風(fēng)通絡(luò)丸［1-2］。

中風(fēng)通絡(luò)丸由黃芪、葛根、丹參等16 味中藥組成，是湘西土家族苗族自治州民族中醫(yī)院名老中醫(yī)經(jīng)驗方，經(jīng)過大量的臨床驗證，治療中風(fēng)應(yīng)用安全且具有較好的療效。中風(fēng)通絡(luò)丸功能益氣活血，化瘀通絡(luò)，平肝息風(fēng)，用于腦梗死恢復(fù)期氣虛血瘀，風(fēng)陽上擾證，癥見半身不遂、口舌歪斜、語言不清、偏身麻木、頭暈?zāi)垦５?。本文用HPLC 法對其君藥之一丹參的有效成分進行含量測定研究，旨在建立簡便、有效、可靠的質(zhì)量控制方法［3-4］。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Shimadzu 高效液相色譜(UV 檢測器，LC solution 色譜工作站);色譜柱是依利特Hypersil-ODS(4.6 mm ×250 mm，5μm)。電子天平(AND GH-202，十萬分之一，日本)，超聲波清洗器(KQ-250DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑

丹參酮ⅡA和丹酚酸B 對照品由湖南省藥品檢驗研究院提供，供含量測定用;中風(fēng)通絡(luò)丸(批號:20121101、20121102、20121103)，由長沙同瑞醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純;其他試劑為分析純;水為樂百氏純凈水經(jīng)0.45μm 過濾后得。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取丹參酮ⅡA1.0 mg 和丹酚酸B 對照品3.0 mg，置50 mL 容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2 供試品溶液和陰性對照溶液的制備［7］

取中風(fēng)通絡(luò)丸20 g，研碎，過80 目篩，精密稱取10 g，置100 mL 容量瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，冷卻后加甲醇至刻度，搖勻，靜置備用。同法制備不含丹參的陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件［5-6］

色譜柱為依利特Hypersil-ODS (4.6 mm ×250 mm，5μm);流動相為乙腈－0.5%甲酸溶液;梯度洗脫:0 ～15 min，乙腈10% ～20%;15 ～25 min，乙腈20% ～50%;25 ～35 min，乙腈50% ～60%;35 ～40 min，乙腈60% ～95%，;流速為1.0 mL·min－1;檢測波長丹參酮ⅡA為270 nm，丹酚酸B 為286 nm;柱溫為30℃。

2.4 方法可行性考察

精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，按上述色譜條件進樣，丹參酮ⅡA和丹酚酸B 的色譜理論塔板數(shù)均大于10000，與相鄰雜質(zhì)峰的分離度＞1.5，對照品丹參酮ⅡA和丹酚酸B 以及供試品溶液、陰性對照溶液的色譜圖見圖1。

圖1 樣品色譜圖(A 丹參酮ⅡA 對照品溶液;B 丹酚酸B 對照品溶液;C 供試品溶液;D 空白樣品溶液)

2.5 線性關(guān)系

2.5.1 丹參酮ⅡA的線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1”項下的對照品溶液10、14、18、22、26 μL，按上述色譜條件分別進樣測定峰面積，以進樣量X(μg)對色譜峰面積Y 進行線性回歸求得丹參酮ⅡA的線性方程為:Y=4×106X+175439 (r =0.9998)，線性范圍為0.1861 ～0.4839 μg。

2.5.2 丹酚酸B 的線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1”項下的對照品溶液10、20、25、30、35μL，按上述色譜條件分別進樣測定峰面積，以進樣量X(μg)對色譜峰面積Y 進行線性回歸求得丹酚酸B 的線性方程為:Y =2 ×106X +36551(r=0.9998)，線性范圍為0.6258 ～2.1902μg。

2.6 精密度試驗

精密吸取對照品溶液20，在“2.3”色譜條件下，連續(xù)進樣6 次，分別測定丹參酮ⅡA和丹酚酸B 的峰面積，計算RSD 分別為0.18%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液依次在0，2，4，8，12，24 h進樣，測定峰面積，計算RSD 分別為0. 54%、0.20%，表明丹參酮ⅡA和丹酚酸B 溶液在室溫避光條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的中風(fēng)通絡(luò)丸粉末6 份，每份0.25 g，分別加入已知濃度的對照品溶液2、2、4、4、8、8 mL，按供試品制備方法，定容至50 mL，依法測定，結(jié)果見表1。

表1 丹參酮ⅡA 和丹酚酸B 的方法回收率

2.9 樣品測定

按上述方法測定3 個批次的中風(fēng)通絡(luò)丸中丹參酮ⅡA和丹酚酸B 的含量，結(jié)果見表2。

表2 中風(fēng)通絡(luò)丸中丹參酮ⅡA 和丹酚酸B 的含量

3 討論

采用不同溶劑(甲醇和乙醇)、不同提取方法和不同提取時間制備供試品溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇超聲提取30min 時，丹參酮ⅡA和丹酚酸B 的含量的含量最高，且制備的供試品色譜中雜質(zhì)較少。探討了不同流動相的分離效果，結(jié)果表明流動相為乙腈－0.5%甲酸溶液，進行梯度洗脫時，目標峰與雜質(zhì)峰能很好地分離，且峰形對稱，實驗數(shù)據(jù)具有很好的準確度和精密度，且重現(xiàn)性較好，符合液相分析要求。

本文所述方法測定中風(fēng)通絡(luò)丸中丹參酮ⅡA和丹酚酸B 的含量，結(jié)果可靠，可作為該制劑的質(zhì)量控制，建議本制劑丹參酮ⅡA的含量不低于0. 15 mg/g，丹酚酸B 的含量不低于0.9 mg/g。

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