大鼠離斷肢體灌注的實(shí)驗(yàn)研究

王 楠，韓 巖，劉虎仙，陳 淼

(解放軍總醫(yī)院整形修復(fù)科，北京 100853)

在當(dāng)今醫(yī)療領(lǐng)域，腎臟、肝臟、心臟的器官移植技術(shù)日臻完善，在圍手術(shù)期器官保存方面積累了很多經(jīng)驗(yàn)。而對(duì)于整形修復(fù)外科涉及的斷肢斷指再植的術(shù)前保護(hù)，還停留在一個(gè)比較低的水平，缺乏與之相匹配的器官保護(hù)液。本次實(shí)驗(yàn)研究擬通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)國內(nèi)外常用的幾種器官保護(hù)液在大鼠離斷肢體模型中所發(fā)揮的作用進(jìn)行對(duì)比，探討離斷肢體再植前是否需要對(duì)肢體行灌注處理，找出適用于離斷肢體灌注保護(hù)的器官保護(hù)液，優(yōu)化灌注效果，提高肢體再植的成功率。報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

10%水合氯醛溶液，0.9%氯化鈉注射液，ViaSpan(BELZER UW)器官冷藏液(Bristol Myers Squibb B.V. 生產(chǎn))，CUSTODIOL HTK 溶液(FRANZ KOEHLER CHEMIE GMBH 生產(chǎn))，乳酸鈉林格注射液，肝素鈉注射液，地塞米松磷酸鈉注射液，Dulbecco's Modified Eagle Medium 細(xì)胞培養(yǎng)液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，中性福爾馬林溶液，蘇木精粉劑(上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝)，伊紅粉劑(北京化工廠產(chǎn)品)。生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(8T-12K 亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所)，病理組織包埋機(jī)(BM-1 安徽省電子科學(xué)研究所)，切片漂烘溫控儀(QP-B2 安徽省電子科學(xué)研究所)，光學(xué)顯微鏡(ICC50 LEICA，德國)，工作站計(jì)算機(jī)(Z470 聯(lián)想，中國)，全自動(dòng)生化分析儀(7170 HITACHI，日本)。

1.2 大鼠離斷肢體缺血模型的制備

健康成年Wistar 大鼠(雄性)40 只(體重在300 ～400g，由解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為4 組。用10%水合氯醛溶液1.5mL 腹腔注射麻醉。約5 分鐘麻醉生效后雙下肢、腹部及背部剃毛，將大鼠置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，固定四肢。在雙側(cè)腹股溝處設(shè)計(jì)弧性手術(shù)切口。沿標(biāo)記線切開大鼠皮膚，分離皮下脂肪組織，分離出大鼠股動(dòng)脈、股靜脈及股神經(jīng)，術(shù)中結(jié)扎并離斷同側(cè)旋髂動(dòng)靜脈及陰部動(dòng)靜脈，在骶尾部行銳性分離，在股骨頭處離斷髖關(guān)節(jié)，使股動(dòng)靜脈得到最大限度的暴露。通過(0，7 ×19mm)一次性使用靜脈留置針對(duì)股動(dòng)脈進(jìn)行穿刺，插管成功后，綁管線固定牢靠。向股動(dòng)脈灌注肝素鹽水，行抗凝保護(hù)。同理對(duì)股靜脈穿刺插管后，結(jié)扎股動(dòng)、靜脈。對(duì)側(cè)肢體行相同處理后，沿標(biāo)記線完整離斷雙側(cè)下肢，將大鼠下肢皮膚由遠(yuǎn)端至近端連續(xù)對(duì)位縫合，包裹骨骼肌肉組織，減少暴露面積，避免過度蒸發(fā)。

1.3 大鼠離斷肢體缺血模型的實(shí)驗(yàn)處理

A 組每只大鼠離斷下肢行UW 液灌注;B 組每只大鼠離斷下肢行HTK 液灌注;C 組每只大鼠離斷下肢行林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉灌注;D 組每只大鼠離斷下肢作為對(duì)照組，單純行生理鹽水灌注，灌注液自股動(dòng)脈灌入，使用輸液泵控制滴速及灌注壓，排除肢體過度腫脹及遠(yuǎn)端灌注不足的影響。將滴速設(shè)置為12mL/小時(shí)，連續(xù)灌注24 小時(shí)，灌注全程在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行。

1.4 標(biāo)本取材

自大鼠雙下肢離斷起計(jì)時(shí)，在第4h、8h、12h、16h、20h、24h 時(shí)間點(diǎn)取1mL 灌出液進(jìn)行生化指標(biāo)檢測。在第12h、24h 時(shí)間點(diǎn)取肢體標(biāo)本做病理切片。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠肌肉、血管組織結(jié)構(gòu)病理變化

將大鼠離斷下肢固定于木板上，于膝關(guān)節(jié)上1cm 處取同時(shí)包含動(dòng)靜脈的肌肉組織塊(1cm* 1cm* 1cm)，依次編號(hào)。將編號(hào)的組織塊用10%福爾馬林固定48h，再置于90%、95%乙醇各12h，用無水乙醇脫水2 次(每次12h)，二甲苯透明2 次(每次12h)，以上操作均在常溫中進(jìn)行。之后，于60℃浸蠟。浸蠟過程中使組織塊平展，標(biāo)本應(yīng)完全浸泡在浸泡液內(nèi)。將石蠟包埋好的組織塊置于滑動(dòng)式切片機(jī)上切片，切片厚度為5um，依次編號(hào)，標(biāo)記好順序。于45℃恒溫水浴箱中展片，撈至常規(guī)大小的載玻片上，所有切片行蘇木素-伊紅(HE)常規(guī)染色。在光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

1.5.2 大鼠離斷肢體灌出液ALP、ALT、GLU 的生化指標(biāo)檢測

按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，采用不同灌注液對(duì)大鼠離斷肢體進(jìn)行灌注，在股靜脈插管處收集灌出液，依次編號(hào)，標(biāo)記好灌注時(shí)間及灌注液種類，保存于–20℃冰箱中，待送臨床試驗(yàn)檢測中心生化室，置于日立7170 型全自動(dòng)生化分析儀中，進(jìn)行ALP、ALT、GLU生化指標(biāo)檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)得數(shù)據(jù)整理，進(jìn)行方差分析，結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，取α =0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P ＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 在光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)病理變化(附表1)

附表1 光鏡觀察組織結(jié)構(gòu)比較

圖1

圖2

圖3

圖4

圖5

圖6

2.1 相關(guān)生化指標(biāo)的檢測結(jié)果(附表2、附表3、附表4)

附表2 組織中ALP 含量的變化分析

附表3 組織中ALT 含量的變化分析

附表4 組織中GLU 含量的變化分析

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比四組數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)A、B、C 組與作為對(duì)照組的D 組存在顯著性差異(P ﹤0.01)，即使用UW 液、HTK 液及林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉灌注液對(duì)大鼠離斷肢體進(jìn)行灌注與單純使用生理鹽水灌注組相比較，在相同時(shí)間條件下ALT、ALP 升高緩慢，而GLU 含量降低緩慢。A、B、C 組間相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ﹥0.05)。隨灌注時(shí)間延長，各組灌出液中ALP、ALT 均出現(xiàn)進(jìn)行性增高，其中D 組升高幅度明顯高于其余三組。隨灌注時(shí)間延長，各組離斷肢體灌出液中GLU 含量逐漸降低，其中D 組降低幅度同樣明顯高于其余三組。A、B、C 組之間三項(xiàng)生化指標(biāo)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

在現(xiàn)代戰(zhàn)爭中，隨著大規(guī)模殺傷性武器的不斷出現(xiàn)，槍彈傷、爆炸傷的比重明顯增加，發(fā)生肢體離斷、損毀的情況在野戰(zhàn)外科工作中十分常見，英國醫(yī)學(xué)雜志《柳葉刀》調(diào)查報(bào)告顯示，在伊拉克戰(zhàn)場因四肢損傷而致殘的人數(shù)占到傷殘總數(shù)的20%，而到利比亞內(nèi)戰(zhàn)時(shí)期，這一比例則上升到40%［1］。受制于戰(zhàn)場特殊因素所限，很多傷員無法得到及時(shí)有效的治療，最終導(dǎo)致肢體外觀的畸形及功能的喪失，對(duì)部隊(duì)后續(xù)戰(zhàn)斗力的回復(fù)和傷員今后的生活質(zhì)量、心理健康造成了嚴(yán)重的影響。早在上世紀(jì)60年代，隨著顯微外科的發(fā)展，斷指、斷肢再植就成為了可能，整形外科和顯微外科的醫(yī)生在肢體功能重建領(lǐng)域取得了一系列引人矚目的成就，各種新技術(shù)、新方法、新材料不斷應(yīng)用于臨床。但在戰(zhàn)時(shí)，四肢損傷致殘率卻一直居高不下，說明在戰(zhàn)場開展斷肢再植手術(shù)還存在很多問題。真正成功的肢體移植，不僅是要肢體成活，更重要的是功能恢復(fù)，這都與對(duì)離斷肢體的保護(hù)有直接關(guān)系。但戰(zhàn)地醫(yī)院普遍設(shè)立在距離一線戰(zhàn)場較遠(yuǎn)的后方，后送轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間較長，在這期間如何對(duì)離斷肢體進(jìn)行保存，是否需要像肝腎移植一樣對(duì)肢體進(jìn)行灌注保護(hù)，由于沒有專門用于肢體灌注的液體，加之肢體與肝腎等實(shí)質(zhì)器官存在解剖學(xué)差異，使用哪種灌注液才能達(dá)到更好的保護(hù)效果，提高肢體再植的成功率及相關(guān)功能的恢復(fù)，這些問題都有待進(jìn)一步研究。

在當(dāng)今醫(yī)療領(lǐng)域，腎臟、肝臟、心臟的器官移植技術(shù)日臻完善，已廣泛應(yīng)用于臨床，在圍手術(shù)期器官保存、術(shù)后預(yù)防缺血再灌注損傷，抗免疫排斥反應(yīng)等方面也積累了很多寶貴的經(jīng)驗(yàn)。其中在腎臟移植前采用UW 液灌注，心臟移植前采用HTK 液灌注已在國際上達(dá)成共識(shí)，可以起到很好的器官保護(hù)功能，根據(jù)各器官組織對(duì)缺氧缺血耐受的不同，有效的組織灌注通常可以保存腎臟72 小時(shí)，肝臟近30 小時(shí)，心臟24 小時(shí)［2］。而對(duì)于整形修復(fù)外科涉及的斷肢斷指再植的術(shù)前保護(hù)，還停留在一個(gè)比較低的水平，一般認(rèn)為在常溫下缺血不超過6 ～7 小時(shí)，離斷肢體基本上可以再植成活。超過10 ～12 小時(shí)，成活率則顯著降低。保存方式視運(yùn)送距離而定，如受傷地點(diǎn)距醫(yī)院較近，可將離斷肢體用無菌敷料或清潔布類包好，不做特殊處理。如遠(yuǎn)距離運(yùn)送，則應(yīng)采用干燥冷藏法保存，將斷肢用無菌或清潔敷料包好，放入塑料袋中再放在加蓋的容器內(nèi)，外周加冰塊保存，避免斷肢與冰塊直接接觸，也不使用其他液體浸泡，也沒有與之相匹配的器官保護(hù)液出現(xiàn)［3］。研究表明，一種有效的器官保護(hù)液需要具備以下幾種保護(hù)效果:1.減輕低溫條件下易出現(xiàn)的細(xì)胞水腫;2. 可以預(yù)防細(xì)胞的酸化作用，減少酸性物質(zhì)堆積;3. 使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定，減少正負(fù)離子跨細(xì)胞遷移;4. 減少缺血再灌注損傷，抑制氧自由基破壞作用;5. 提高細(xì)胞氧化磷酸化水平，增加糖代謝水平［4］。國外學(xué)者對(duì)UW 液及HTK 液的實(shí)驗(yàn)研究已十分透徹，充分肯定了兩種器官保護(hù)液在抑制低溫水腫、細(xì)胞損傷方面的作用，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明:UW 液、HTK 液均可明顯延長組織器官對(duì)低溫缺血的耐受，可以使器官功能的損害從33%分別下降到23%和28%。證明UW 液對(duì)腎臟、肝臟、HTK 液對(duì)心臟具有良好的保護(hù)效果［5］。但也有研究報(bào)道提到器官保護(hù)液的高鉀高鈉離子對(duì)血管內(nèi)皮存在一定程度的損害。同時(shí)UW 液粘滯性很高，也可對(duì)臟器細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞造成不同程度的損害［6］。另一方面UW 液與HTK 液均無法國產(chǎn)，只能通過國內(nèi)代理商引入中國市場，這就間接導(dǎo)致兩種器官保護(hù)液價(jià)格十分昂貴，單純的術(shù)前器官保護(hù)性灌注就需要花費(fèi)上萬元，給患者及家屬造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)中涉及的自配灌注液在南方醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院等單位均成功應(yīng)用于臨床，并證實(shí)有效［7］。

本次實(shí)驗(yàn)研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)國內(nèi)外常用的幾種器官保護(hù)液在大鼠離斷肢體模型中所發(fā)揮的保護(hù)作用進(jìn)行比較，論證離斷肢體再植前是否需要對(duì)肢體行灌注保護(hù)，找出適用于離斷肢體灌注保護(hù)的器官保護(hù)液，優(yōu)化灌注效果，提高肢體再植的成功率。

實(shí)驗(yàn)中所采納比較的生化指標(biāo)的意義:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、葡萄糖(GLU)。正常狀態(tài)下，大鼠下肢骨骼肌細(xì)胞內(nèi)含有大量的堿性磷酸酶(ALP)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。當(dāng)離斷肢體后，骨骼肌細(xì)胞因缺血致肌細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜發(fā)生破裂，大量的生物活性酶類釋放入血，故可以通過測定ALP、ALT 酶的數(shù)量變化來判定離斷肢體肌細(xì)胞缺血損傷的程度。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要在肌細(xì)胞內(nèi)含量較高，隨著缺血時(shí)間延長，其數(shù)值變化具備一定的規(guī)律性。國外研究發(fā)現(xiàn)，缺血損傷發(fā)生早期，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)隨時(shí)間延長呈直線上升趨勢，到達(dá)峰值后逐步回落。而堿性磷酸酶(ALP)與ALT 不同，主要分布于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜，同時(shí)其在細(xì)胞肌膜上均勻分布著呈線性排列的酶顆粒。研究表明ALP 的變化規(guī)律與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)大致相同，都是先上升后下降，最后隨著缺血時(shí)間的進(jìn)一步延長最終消失［8］。葡萄糖(GLU)是肌體糖代謝的重要物質(zhì)，也是主要的供能物質(zhì)。當(dāng)離斷下肢開始發(fā)生缺血損傷時(shí)，肌體正常的有氧氧化途徑障礙，直接供能物質(zhì)ATP 產(chǎn)量迅速下降，大量肌酸磷酸在轉(zhuǎn)化為ATP 供能的同時(shí)，糖酵解途徑單方面加強(qiáng)，使得GLU 含量顯著下降［9］。

大鼠離斷肢體缺血模型建立后不同時(shí)間組織的變化的意義。實(shí)驗(yàn)表明，在同樣缺血的條件下，隨著缺血再灌注時(shí)間的延長，組織的損傷情況越重，即再灌注損傷的嚴(yán)重程度與時(shí)間成正比，而在行肢體再植術(shù)前，對(duì)離斷肢體進(jìn)行灌注處理，可以有效的減輕水腫，減少氧自由基等有害成分的生成，達(dá)到增強(qiáng)肢體和相關(guān)機(jī)體抵抗再植及再灌注損傷的能力，使組織功能得到最大限度的保存，為提高肢體再植手術(shù)成功率提供一定的基礎(chǔ)。離斷肢體的損傷自離斷起同步發(fā)生，組織細(xì)胞由于缺血發(fā)生細(xì)胞水腫，滲透壓也隨之發(fā)生改變，隨著時(shí)間的推移，氧自由基等有害物質(zhì)產(chǎn)生增多，導(dǎo)致缺血再灌注損傷的發(fā)生。因此在離斷之初就進(jìn)行離斷肢體灌注保護(hù)是十分必要的。通過實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)即使采用灌注保護(hù)，再植的最佳手術(shù)時(shí)間是在離斷12 小時(shí)內(nèi)，臨床上也通常是采用12 小時(shí)以內(nèi)作為手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)［10］。

光鏡下組織大體結(jié)構(gòu)的變化情況，光學(xué)顯微鏡可以觀察組織細(xì)胞的大體形態(tài)，從本部分實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各組隨著時(shí)間的延長，組織損傷情況逐漸加重。而各灌注組與對(duì)照組相比較，在相同時(shí)間點(diǎn)損傷程度較輕，病理變化較小。各對(duì)照組之間進(jìn)行比較可發(fā)現(xiàn)UW 液灌注組損傷程度明顯輕于其他三種灌注保護(hù)液。說明對(duì)離斷肢體行灌注處理具有細(xì)胞保護(hù)作用，其中UW 液保護(hù)效果最佳，但隨著時(shí)間推移，即便使用灌注液進(jìn)行保護(hù)處理，組織損傷仍會(huì)不可避免的發(fā)生、加重。因此應(yīng)謹(jǐn)慎選擇肢體再植時(shí)間，避免出現(xiàn)累及全身的病理變化。

灌注保存時(shí)需要注意的問題。臨床資料表明:影響再植肢體功能恢復(fù)，造成組織損傷的主要原因是由缺血損傷及血液再通后的再灌注損傷共同組成。而其中的關(guān)鍵在于減少肢體缺血時(shí)間，在行灌注液灌注保護(hù)前盡可能縮短機(jī)體缺血時(shí)間，盡快通血，才能有效的減低缺血損傷及再灌注損傷［11］。同時(shí)使用灌注液進(jìn)行灌注保護(hù)可以有效的稀釋毒性代謝產(chǎn)物，減輕組織損傷。在灌注過程中合理設(shè)定灌注壓力，通常情況下應(yīng)低于正常組織血流速度，避免因壓力過大對(duì)組織造成機(jī)械性損傷，因?yàn)殡x斷肢體極易發(fā)生細(xì)胞水腫，導(dǎo)致細(xì)胞脆性增加，對(duì)損傷的耐受程度減低。整個(gè)灌注過程在低溫下進(jìn)行(4℃)，在低溫條件下，離斷肢體溫度降低可以有效的減少無氧代謝，使因?yàn)闊o氧代謝產(chǎn)生的自由基等有害物質(zhì)減少，同時(shí)也可以在一定程度上減輕炎癥反應(yīng)。

結(jié)合光鏡、電鏡分別觀察各組間離斷肢體肌肉組織的大體損傷情況以及提取的生化指標(biāo)可以發(fā)現(xiàn):三種灌注液UW 液、HTK 液及林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉混合灌注液均可以對(duì)離斷肢體起到保護(hù)作用，延長細(xì)胞活性時(shí)間，且在對(duì)肢體保護(hù)作用上要強(qiáng)于使用生理鹽水空白灌注。其中UW 液對(duì)離斷肢體的保護(hù)作用明顯強(qiáng)于其他兩種灌注液，HTK 液與林格氏液+地塞米松+低分子肝素鈉混合灌注液在對(duì)組織保護(hù)的作用上差異不大。

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