一個花生新SSR標(biāo)記的開發(fā)

尹亮+許夢琦+任艷+石延茂+王輝+李雙鈴+袁美

摘 要：本研究利用SCoT12引物對8個不同花生品種擴(kuò)增產(chǎn)物中的一個長度多態(tài)性片段SCoT12-800進(jìn)行克隆和測序分析，該序列登錄號為KM200036。結(jié)果表明，該片段多態(tài)性是由于其含有一段TC簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat， SSR），根據(jù)該片段序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出一對適合SSR分子標(biāo)記檢測的引物，命名為SCoT12-SSR，該引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為164～178 bp，在花生栽培種中可檢測到5個等位變異，可用于花生的遺傳多樣性、品種鑒定、基因定位和遺傳圖譜的構(gòu)建等研究。

關(guān)鍵詞：花生；分子標(biāo)記；SCoT；SSR

中圖分類號：S565.2+Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2014）11-0008-05 花生（Arachis hypogaea L.）又名落花生，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物之一。栽培花生是包含來自于不同野生品種A和B兩個基因組的異源四倍體作物[1]。研究表明，單一雜交多倍化以及在育種過程中高頻使用少數(shù)骨干親本，使得品種間的遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄，基因組高度保守，遺傳多樣性降低[2]。因此，了解栽培花生品種間的遺傳多樣性，開發(fā)有效的遺傳多樣性標(biāo)記對于花生育種以及種質(zhì)鑒定都具有重大意義。

SSR（Simple Sequence Repeat）又稱為微衛(wèi)星DNA，是指由2～6個核苷酸為基本單位多次串聯(lián)重復(fù)所構(gòu)成的一段DNA序列。SSR標(biāo)記技術(shù)與目前常用的如RFLP、RAPD、STS、SCAR、SPAR、AFLP等標(biāo)記技術(shù)相比， 具有分布均勻、簡單快速、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好以及多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，因此在水稻[3]、玉米[4]、小麥[5]等作物研究中得到了廣泛應(yīng)用?；ㄉ鶶SR分子標(biāo)記的開發(fā)相對緩慢，雖然目前已經(jīng)公布的花生SSR分子標(biāo)記數(shù)達(dá)到了15 518，但只有13.5%～14.5%的分子標(biāo)記在花生栽培種中具有多態(tài)性[6，7]，很難滿足現(xiàn)今的科研需求。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（Start Codon Targeted Polymorphism，SCoT）分子標(biāo)記是由Collard和Mackill[8]開發(fā)的一種目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)，該標(biāo)記依據(jù)植物基因中ATG翻譯起始位點(diǎn)側(cè)翼序列的保守性，設(shè)計(jì)單引物對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。SCoT分子標(biāo)記技術(shù)產(chǎn)生的標(biāo)記大部分是顯性標(biāo)記（引物結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變），但也會產(chǎn)生像RAPD標(biāo)記技術(shù)一樣的由于插入-缺失突變引起的長度多態(tài)性共顯性標(biāo)記，其產(chǎn)物片段大小在200～2 000 bp之間。SCoT分子標(biāo)記作為一種新型的分子標(biāo)記具有操作簡便、可在各物種間通用、能有效產(chǎn)生與性狀連鎖的標(biāo)記等特點(diǎn)。目前，該標(biāo)記技術(shù)已在水稻、馬鈴薯[9]等作物中成功應(yīng)用，在花生中也有報(bào)道[10，11]。但由于該技術(shù)采用單引物擴(kuò)增，使其存在擴(kuò)增條帶過多，特別是一些共顯性插入-缺失片段由于差異不明顯而造成結(jié)果不易分析等缺點(diǎn)。

本研究利用已公布的SCoT分子標(biāo)記對8個不同的花生品種進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)其中一個引物SCoT12擴(kuò)增產(chǎn)物中的一個片段存在長度多態(tài)性差異。測序結(jié)果表明該片段包含一段TC重復(fù)，并利用該序列成功開發(fā)出了一個具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

8個供試品種，分別為950527、花育22號、DF12、開農(nóng)176、開17-15、York-1、Q13-2-1、Q13-21-1。所用供試材料均種植于山東省花生研究所試驗(yàn)基地，并在苗期取健康植株上的無病蟲害幼嫩葉片，液氮速凍后于-70℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及PCR反應(yīng) 基因組DNA提取采用小量CTAB法，并做了相應(yīng)改良。SCoT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照熊發(fā)前等[12]報(bào)道的方法進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的PCR體系總體積為10 μL，含2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]3.75 μL、0.5 μmol/L引物、50 ng基因組DNA。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；72℃最后延伸5 min。SSR-PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃最后延伸5 min。SCoT-PCR使用SCoT12引物[11]，SSR-PCR使用根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)的SCoT12-SSR引物（引物序列見表1）。

1.2.2 PCR產(chǎn)物電泳檢測 SCoT-PCR與SSR-PCR產(chǎn)物分別使用濃度為3.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠和6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（電泳緩沖液0.5×TBE，電壓150 V，時間2 h），0.1% AgNO3染色，對電泳結(jié)果進(jìn)行拍照。測序片段檢測及回收使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用GelRed（Biotium，USA）染色，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并切下目標(biāo)條帶所在膠塊放入2 mL EP管中備用。

1.2.3 PCR產(chǎn)物目的片段回收、連接載體及測序 目的片段的回收、純化使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]。將回收的目的片段與pMD19-T Vector（Simple）（TaKaRa，大連）連接后，使用熱激法轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技（北京）有限公司]，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色菌斑進(jìn)行PCR檢測，方法參考產(chǎn)品說明書。將檢測后陽性克隆菌落接入5 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液送金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序及菌落PCR檢測均使用M13引物（引物序列見表1）。

1.2.4 測序結(jié)果分析 測序結(jié)果經(jīng)DNASTAR軟件中SeqMan拼接完整，利用MegAlign比較不同供試材料間該位點(diǎn)的多態(tài)性，并通過NCBI BLAST進(jìn)行相似性檢測以及閱讀框分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT12擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性分析

在8個供試品種中，SCoT12引物可擴(kuò)增出11條清晰、穩(wěn)定條帶（圖1），片段大小在300～2 000 bp之間。其中，不同品種在800 bp處均可檢測到一條大小有微小差異的片段，將該片段命名為SCoT12-800。

2.2 SCoT12-800陽性克隆檢測

使用M13引物對重組載體pMD19-T+SCoT12-800的轉(zhuǎn)化菌株的不同單克隆進(jìn)行PCR檢測（圖2），其中有SCoT12-800片段插入的克隆PCR擴(kuò)增片段長度應(yīng)為930 bp左右，而有些克隆的擴(kuò)增片段長度不在上述范圍，可能是pMD19-T載體在連接過程中插入了其他片段或是載體發(fā)生自連而產(chǎn)生了假陽性。

2.3 測序結(jié)果分析

對上述長度多態(tài)性片段的測序結(jié)果顯示該擴(kuò)增片段長度為808～822 bp，片段內(nèi)部存在一段TC多次重復(fù)構(gòu)成的SSR序列位點(diǎn)。圖3為花生品種DF12的SCoT12-800的核苷酸序列， TC重復(fù)單元的次數(shù)為32。所選供試品種的測序結(jié)果顯示該位點(diǎn)存在5種不同的變異類型（圖4）。

2.4 序列比對及SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)

為了明確該SSR標(biāo)記是否為已公布SSR標(biāo)記，將上述測序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對分析。結(jié)果顯示該序列是一個新發(fā)現(xiàn)的花生SSR序列，GenBank登錄號為KM200036。根據(jù)該片段序列

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出一對適合SSR分子標(biāo)記檢測的引物，命名為SCoT12-SSR（表1）。其正向引物長度20 bp，GC含量50%，Tm值60℃；反向引物長度20 bp，GC含量55%，Tm值62℃。電泳檢測結(jié)果顯示該位點(diǎn)存在164、168、172、174、178 bp 5個等位變異（圖5），電泳檢測結(jié)果與測序結(jié)果吻合。

3 結(jié)論與討論

SCoT分子標(biāo)記是根據(jù)基因起始密碼子（ATG）兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)的單引物擴(kuò)增片段，其擴(kuò)增產(chǎn)物由于不同品種間啟動子兩端堿基變化以及堿基插入-缺失引起的變化而表現(xiàn)出一定的多態(tài)性[6]。此外，因?yàn)槠鹗济艽a子（ATG）是功能基因的一個組成部分，所以SCoT標(biāo)記技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記很有可能與決定不同品種特性的功能基因相關(guān)聯(lián)[12]。本研究對SCoT12-800片段進(jìn)行閱讀框分析，并未發(fā)現(xiàn)包含具有編碼功能的閱讀框，說明該標(biāo)記片段與決定品種間差異特性的功能基因不關(guān)聯(lián)。但由于SCoT分子標(biāo)記廣泛分布在整個基因組上，利用本研究方法對其他多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行序列分析，有可能檢測到一些與品種特性相關(guān)的功能基因。

另外，由于SCoT分子標(biāo)記擴(kuò)增片段大小在200～2 000 bp之間[13]，而其長度多態(tài)性差異通常在幾個堿基至幾十個堿基之間，利用現(xiàn)有SCoT檢測方法（1.5%瓊脂糖凝膠電泳或3.5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳）無法精確區(qū)分該標(biāo)記，因此通過對SCoT長度多態(tài)性標(biāo)記片段進(jìn)行測序分析，可以清楚地了解該片段的序列，并開發(fā)出更方便、精確的分子標(biāo)記。本研究通過對SCoT12分子標(biāo)記中的一個長度多態(tài)性片段進(jìn)行測序分析，開發(fā)出了一個新的SCoT12-SSR分子標(biāo)記，該SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確區(qū)分此位點(diǎn)上的5個不同的等位變異。因此，利用該方法開發(fā)新的多態(tài)性標(biāo)記是對現(xiàn)有花生多態(tài)性分子標(biāo)記的補(bǔ)充。

參 考 文 獻(xiàn)：

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