高等院校農(nóng)林專業(yè)基因工程實驗教學改革探索與實踐

段永波，趙豐蘭，宋運賢，盛 瑋，薛建平(淮北師范大學生命科學學院，資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北235000)

作為生命科學的重要組成部分，基因工程與細胞工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程在分子、細胞、酶學、蛋白水平共同組成了現(xiàn)代生物工程。其通過將所需的生物遺傳物質(zhì)——脫氧核糖核酸(DNA)從供體生物分離出來，用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行切割后連接至表達載體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞并整合至其基因組，使得目標基因在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，進而發(fā)揮其功能。自上世紀70年代誕生以來［1］，基因工程已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)保等各領(lǐng)域，在推動現(xiàn)代生命科學的發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用。

目前，基因工程已作為生物科學和生物工程專業(yè)的一門核心專業(yè)基礎(chǔ)課，在綜合性大學、農(nóng)業(yè)大專院校、師范和醫(yī)科大學等各類高校陸續(xù)開設(shè)。該課程的整條主線都是基于DNA水平的操作，基本屬于“無實物”教學，給課程學習帶來了很大難度。因此，基因工程實驗就成了非常必要的輔助課，也是引導(dǎo)學生將理論知識應(yīng)用于實踐，培養(yǎng)科學分析思維能力和創(chuàng)新能力的一門方法學課程。因其要求學生具備生化及分子生物學基本知識和操作技能，單個試驗中間有時間間隔，實驗周期較長，涉及昂貴儀器和試劑的使用，給課程教學帶來很大挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的基因工程實驗技術(shù)教程主要集中于基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證［2］，所開設(shè)實驗常涉及一整套該課程實驗技術(shù)，包括培養(yǎng)基配制和高壓滅菌等常規(guī)實驗。原來該課程教學目的主要是驗證基因工程操作原理，在創(chuàng)新研究方面的內(nèi)容不多。此外，驗證性的實驗結(jié)果難以帶給學生創(chuàng)造性的“成就感”，實驗過程多是填鴨式的被動完成。這會導(dǎo)致學生完全機械性地“做實驗”，以致教學效果不佳。為提高教學效果，培養(yǎng)實踐技巧和科學思維能力，針對高等院校農(nóng)林專業(yè)特點，筆者將系統(tǒng)工程與模塊化設(shè)計相結(jié)合，應(yīng)用于該課程教學并取得很好的教學效果。

1 課程建設(shè)思路與設(shè)計

該課程在淮北師范大學主要針對師范專業(yè)學生開設(shè)，多數(shù)學生在畢業(yè)后將從事高中生物教學。近年來，基因工程及分子生物學實驗設(shè)計在高考中占有非常重要的地位。在開設(shè)此門課程之前，學生已經(jīng)累積了微生物學、遺傳學、分子生物學等課程及其相應(yīng)的實驗技術(shù)。因此，該課程建設(shè)旨在保證學生在完全理解基因工程內(nèi)涵的基礎(chǔ)上，進一步培養(yǎng)學生的科研態(tài)度和創(chuàng)新思維。

該課程僅保留基因工程實驗課程中“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”的經(jīng)典內(nèi)容［3］，在有限的課時內(nèi)完成了從目的基因克隆到載體構(gòu)建過程，并實現(xiàn)所構(gòu)建載體在植物中表達的整個過程。基于傳統(tǒng)實驗課程中所獲結(jié)果直觀性不強的缺點，筆者在教學中引入了啟動子、報告基因和終止子3個元素，通過從植物基因組DNA中克隆啟動子、相關(guān)質(zhì)粒中擴增報告基因連接至表達載體，并實現(xiàn)其在植物細胞中表達，讓學生完成從基因水平到蛋白表達水平整個過程，同時檢測報告基因表達，直觀地感受實驗的魅力，提高教學效果。

整體實驗流程設(shè)計劃分為3個相對獨立的模塊，每個模塊都可獨立考核，其后也能放置較長時間至下一個實驗(圖1)。整個課程中學生將完成基因表達所需元件中啟動子和基因的功能分析。同時，以水稻或玉米2中植物作為實驗材料克隆啟動子，還提供含β－1，4糖苷酶gus的大腸桿菌供克隆報告基因。讓學生提前查詢資料熟悉引物設(shè)計的原則及方法，親自設(shè)計PCR引物(包括在引物末端添加酶切位點)，掌握報告基因gus作用機理，并根據(jù)自身興趣選擇實驗材料，進而提高其完成實驗的主動性。

2 教學方案實施

圖1 整體教學設(shè)計流程

筆者以基因表達框為出發(fā)點，以報告基因為研究對象，改變了傳統(tǒng)基因工程實驗課程中實驗結(jié)果主要以電泳圖譜的單一形式呈現(xiàn)的缺點，將實驗最終結(jié)果以報告基因在植物細胞中的表達檢測來呈現(xiàn)。同時，將系統(tǒng)工程和模塊化設(shè)計思路引入課程教學，形成整個課程于一個完整實驗，又將其劃分為3個獨立模塊，既提高了學生對實驗的興趣，又解決了實驗課時間安排的難題。采用小班教學模式，分2人一小組，保證師生間充分交流及學生對實驗的充分理解。

在介紹實驗整體流程時，根據(jù)實驗內(nèi)容創(chuàng)造問題情景，引導(dǎo)學生實驗前查詢所設(shè)置問題可能出現(xiàn)的原因及解決辦法。比如:研究水稻及玉米等作物基因工程技術(shù)的目的、意義及發(fā)展方向，報告基因gus作用機理，電泳中EB染色原理，基因克隆及載體構(gòu)建過程中的難點，農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物細胞的原理等。

整個實驗課程均始終貫穿以學生為主，教師為導(dǎo)的教學思想。目前表達載體構(gòu)建中質(zhì)粒DNA提取、酶切、連接等操作都有相應(yīng)的試劑盒，因此將課程重點由原來的克隆驗證轉(zhuǎn)到從目標基因克隆直至在真核細胞中的表達上。

在開始各實驗單元模塊前，介紹實驗原理及操作步驟，同時引出相應(yīng)的問題供學生討論。在目的基因PCR擴增實驗中，引導(dǎo)學生對其所選植物研究意義進行討論，最后教師總結(jié)，指出采用基因工程技術(shù)改良玉米和水稻等重要農(nóng)作物對保障人類糧食安全的重要意義。同時在PCR和酶切實驗間歇增加了電子克隆知識介紹、引物設(shè)計方法及如何通過酶切位點實現(xiàn)基因工程中的“剪切—拼接”過程，采用多媒體展示現(xiàn)代生物學知識發(fā)展的日新月異。這樣即可將學生興趣、理論知識和實踐很好地結(jié)合，使學生加深對實驗的理解，提高教學效果。

筆者以表達報告基因gus為目標，讓每組同學都克隆啟動子和目的基因這2個表達框中的重要元件，并在生菜中瞬時表達。提供給學生由筆者構(gòu)建的含有g(shù)us但無啟動子的載體pCAMBIA1381，以及有CaMV35S啟動子但不含報告基因的載體pCAMBIA1305.1。將所構(gòu)建的啟動子及報告基因功能分析的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，瞬時轉(zhuǎn)化生菜，會得到2組對照載體及上述所構(gòu)建載體。通過報告基因表達分析會得出這樣的結(jié)果:只有啟動子或報告基因都不能表達，必須要2個元件同時存在才能檢測到外源基因表達。結(jié)合實驗過程中介紹的基因內(nèi)含子及表達框中終止子功能，學生即可直觀地理解基因表達框中各個元件的作用。

鼓勵學生以科技論文的形式完成實驗報告，包括題目、作者姓名、摘要、引言、材料與方法、結(jié)果與分析、討論、參考文獻等內(nèi)容，重點注意結(jié)果分析與討論部分，以此加深對實驗的理解。強調(diào)實驗報告是課程考核的重要部分，實驗操作完成不夠理想的學生也可以在此環(huán)節(jié)獲得好成績。

3 結(jié)語

基因工程實驗課程涉及實驗內(nèi)容多、周期長、實驗結(jié)果感官性不強，給學生和教師都帶來了很大挑戰(zhàn)。筆者以基因表達框為基礎(chǔ)，引入啟動子和報告基因2個元件，不僅讓學生同時完成2個元件的克隆及其各自在基因表達中的作用，還避免了外源蛋白檢測所需的蛋白抽提和Western blot等復(fù)雜且不易控制的操作。課程完成后，采用雙向選擇的方式引導(dǎo)學生參與基因工程技術(shù)方向的畢業(yè)設(shè)計與實踐。很多學生將該課程所學知識應(yīng)用到畢業(yè)論文中，也培養(yǎng)了學生的科學思維方法。

基因工程技術(shù)更新極快，但每項技術(shù)發(fā)明后生物技術(shù)公司就會在很短時間內(nèi)研制并發(fā)布相應(yīng)操作規(guī)程，因此未來基因工程實驗技術(shù)的主要目標應(yīng)該轉(zhuǎn)向培養(yǎng)學生的創(chuàng)新創(chuàng)造能力。在今后課程改革中，筆者將嘗試以科研課題為載體，進一步加深基因工程實驗課程與學生畢業(yè)論文設(shè)計的結(jié)合，拓寬學生科研思維，以助于其今后從事教學、科研等工作。

［1］JACKSON D A，SYMONS R H，BERG P.Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40:circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli［J］.PNAS，1972，69(10):2904 －2909.

［2］盛小禹.基因工程實驗技術(shù)教程［M］.上海:復(fù)旦大學出版社，1999.

［3］J·薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2002.