石榴皮提取物抑菌與抗氧化作用研究

王丹苗，黃炳鈺，張興超，袁高峰(浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022)

據(jù)報(bào)道，全球每年由于腐敗變質(zhì)而造成約有10% ～20%的食品損失，其造成的經(jīng)濟(jì)損失是十分驚人的。因此保證食品的品質(zhì)、防止食品及原料腐敗變質(zhì)是食品工業(yè)的重要任務(wù)。人們通常往食品中添加防腐劑來延長食品的保質(zhì)期，由于該方法操作簡便有效且應(yīng)用廣泛，故其仍為食品防腐保鮮的重要手段之一。當(dāng)前，國內(nèi)外多用如山梨酸、苯甲酸、對羥基甲酸脂等化學(xué)合成的防腐劑，其防腐效果好、價(jià)格較低，因而在食品加工中應(yīng)用廣泛。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些防腐劑防腐效果不僅受到溶解度、pH、食品微生物等的限制影響，而且在一定程度上對食用口感、人們身體健康有不良影響，容易引起食物中毒，甚至致癌致畸等問題。越來越多的研究表明，人工合成化合物已引起了一系列的環(huán)境問題。故開發(fā)廣譜、高效、安全且經(jīng)濟(jì)的新型天然防腐劑一直是食品科學(xué)、生物化學(xué)領(lǐng)域的重要課題［1］。

石榴皮是石榴的干燥果皮，除了含有大量多元酚、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、甾醇、黃酮類等活性物質(zhì)外，還含有樹脂蠟、糖、氨基酸等［2］。石榴皮多酚是石榴皮中多酚羥基化合物的總稱，包括鞣花單寧、單寧、鞣花酸和沒食子酸等多種化合物，Ahmad等研究證實(shí)，植物多酚、單寧和類黃酮具有廣泛的抗菌活性［3］。石榴皮多酚中含有的鞣質(zhì)類和黃酮等具有較強(qiáng)的抗氧化作用，如鞣花酸可與金屬離子螯合，并與自由基反應(yīng)，從而具有抗氧化功能［4］。美國科學(xué)家已證實(shí)石榴皮提取物對某些致病菌有抑菌活性［5］。筆者以石榴皮為原料制備石榴皮提取物，研究石榴皮提取物對食品中常見菌如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性和抗氧化活性，以期為石榴皮等加工副產(chǎn)物的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料:石榴皮干制品，購于安徽;菌種:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，浙江海洋學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 提取物制備 將粉碎的石榴皮用20倍的80%甲醇溶液在40℃水浴鍋中溶解4 h，再用0.45 μm濾紙過濾。濾渣用相同量的80%甲醇溶液再提取2次，時(shí)間縮短為2 h和1 h，將全部提取液混合，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(40℃)減壓濃縮濾液，恒溫干燥12 h得到成品。

1.3 石榴皮提取物抑菌直徑測定 先測定菌液濃度，在無菌條件下，將菌液稀釋成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9倍，用移液槍(1 000 μl)分別吸取 1 ml于無菌培養(yǎng)皿上，并將菌液搖開，分別傾倒20 ml已配制好的熔融狀態(tài)的固體培養(yǎng)基(約40℃)，充分搖勻，待凝固，倒置于培養(yǎng)箱(37℃)中。每個濃度梯度3次重復(fù)操作，并設(shè)置一份無菌蒸餾水做空白對照。待24 h后取出，取可計(jì)數(shù)的梯度進(jìn)行計(jì)數(shù)，按以下公式確定菌液濃度:

式中，C為菌液濃度(CFU/ml);M為可計(jì)數(shù)平皿菌落平均個數(shù);N為菌液稀釋倍數(shù)。

將石榴皮提取物凍干粉用80%甲醇按梯度稀釋配制成濃度為 0.800、0.400、0.200 、0.100、0.050、0.025 g/ml，相應(yīng)標(biāo)記備用。無菌條件下，分別吸取1 ml 2種菌懸液加入滅菌培養(yǎng)皿中，與約20 ml融化的固體培養(yǎng)基混勻。在待其培養(yǎng)基凝固前，用滅過菌的鑷子將無菌牛津杯放置平板培養(yǎng)基的相應(yīng)位置，待凝固，將牛津杯取出，并將牛津杯中的殘留培養(yǎng)基取出，形成直徑約8 mm的孔，往每孔注入20 μl提取物，每組3個平行試驗(yàn)，用80%甲醇做空白對照，平放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后觀察并用直尺測量抑菌圈的直徑，記錄并取其平均值。由此判斷石榴皮甲醇提取物對這2種細(xì)菌的抑制效果。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)的測定 將石榴皮提取物用無菌蒸餾水配制成濃度為 2.000、1.500、1.000、0.500、0.250、0.125、0.050 mg/ml的梯度溶液。用移液槍分別吸取2 ml這7個濃度梯度的溶液注入滅菌培養(yǎng)皿中，加入熔融的培養(yǎng)基，充分混勻，待凝固，移取2種菌懸液各0.1 ml，用已滅菌涂布棒迅速抹勻，置恒溫培養(yǎng)箱28℃中培養(yǎng)10 d，觀察細(xì)菌生長情況。無菌落生成的最大稀釋濃度為MIC。

1.5 樣品多酚含量測定 準(zhǔn)確稱量真空干燥至恒重的沒食子酸44.4 mg，用蒸餾水溶解并定容100 ml。將此溶液分別配制成濃度為 37.0、44.4、88.8、111.0、148.0 μg/ml溶液。分別移取上述各濃度溶液1 ml至10 ml比色管中，再分別加入0.5 ml福林 －酚試液，1 ml去離子水，2 ml 26.7%碳酸鈉溶液，用去離子水定容至10 ml，振蕩混勻，置室溫下反應(yīng)2 h，以空白做參比，在波長765 nm處測定吸光度，重復(fù)2次，制作多酚類測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。將真空干燥過的石榴皮甲醇提取物用水溶解，濃度接近為0.08 mg/ml，取1 ml該濃度試液至10 ml比色管中，加1 ml去離子水，0.5 ml福林 －酚試液，2 ml 26.7%碳酸鈉溶液，加去離子水定容至10 ml，在波長765 nm處測定吸光度［6］。將測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得多酚含量。

1.6 羥自由基清除能力測定 將石榴皮甲醇提取物配制成1 mg/ml溶液，再稀釋成適當(dāng)濃度進(jìn)行測定。取0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液1 ml，PBS緩沖液2 ml和蒸餾水1 ml，充分混合后，加0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 ml混勻，加0.01%的H2O21 ml，在37℃下放置60 min，于波長536 nm處測其吸光度，其值為Ap。同上述步驟，其中用1 ml無水甲醇代替1 ml H2O2，測得的吸光度為Ab;用1 ml的試樣液代替第一步驟中的1 ml蒸餾水，測得吸光度為AS。計(jì)算羥自由基清除率(D%)［7］:

1.7 超氧陰離子自由基(O－2·)清除能力測定 取0.05 mol/L，pH 8.2 的 Tris-HCl緩沖液 4.5 ml于試管，水浴(25℃)預(yù)熱20 min，加入樣品 0.1 ml，2.5 mmol/L 鄰苯三酚 0.4 ml，混勻后在水浴(35℃)反應(yīng)4 min，立即加2滴8 mmol/L的HCl終止反應(yīng)，使用紫外－可見分光光度計(jì)在波長(299±1)nm處測定吸收度。使用0.1 ml蒸餾水作為空白組，按下面公式計(jì)算清除率［8－9］:

式中，AC為空白組的吸光值，AS為試驗(yàn)組的吸光值。

1.8 DPPH·清除能力測定 取一定濃度石榴皮甲醇提取物0.1 ml，加入3 ml 0.04%DPPH溶液，混勻后立即用分光光度計(jì)于波長為517 nm室溫下，30 min內(nèi)測量吸光度，讀取穩(wěn)定值?？瞻捉M為1 ml無水甲醇即測定用無水甲醇替代樣品液后的吸光度［10］。計(jì)算公式如下:

式中，ODS為試驗(yàn)組在波長517 nm處的吸光度，ODC為空白組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴皮提取物抑菌活性 由圖1和表1可以看出，石榴皮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有不同程度的抑制作用，并且隨著石榴皮甲醇提取物濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度升高到一定程度，抑制作用趨于穩(wěn)定。

石榴皮提取物對金黃色葡萄球菌在濃度0.025～0.800 mg/ml的抑菌圈直徑均比大腸桿菌大，說明該提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果比大腸桿菌明顯。

圖1 石榴皮提取物抑菌效果

2.2 石榴皮提取物最小抑菌濃度測定 由表2可以看出，石榴皮提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.250 mg/ml，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.500 mg/ml。相同條件下，最小抑菌濃度越小，其抑菌活性越強(qiáng)。即表明石榴皮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于對大腸桿菌的抑制效果。筆者的研究證實(shí)，石榴皮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，可考慮將其作為食品防腐劑加入食品中，以期達(dá)到抑菌的目的。

表1 不同濃度下的石榴皮提取物的抑菌圈直徑

表2 最小抑菌濃度測定

2.3 石榴皮提取物多酚含量和抗氧化活性分析 試驗(yàn)得出，石榴皮提取物富含多酚，其含量達(dá)191.4 mg/g。研究已表明，天然提取物如葡萄籽提取物等含有的多酚對細(xì)菌具有抑制作用，該研究中石榴皮提取物具有的抑菌效果也可能與其富含多酚有關(guān)。

另外，試驗(yàn)得出，石榴皮甲醇提取物對溶液體系中反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基·)具有一定的清除作用。隨石榴皮甲醇提取物濃度的增加，其清除能力也隨之增強(qiáng)。同一體系中，可用半抑制濃度IC50(·OH)來表示石榴皮甲醇提取物的除羥自由基能力的大小。半抑制濃度越小，則表明其清除自由基的能力越強(qiáng)。試驗(yàn)得到的石榴皮甲醇提取物清除羥自由基的IC50(·OH)=0.58 mg/ml，清除超氧陰離子自由基 IC50·)=0.65 mg/ml，IC50(DPPH·)=0.63 mg/ml。由此看出，該提取物對羥自由基的清除作用最強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

該研究以石榴皮為材料制備石榴皮甲醇提取物，研究石榴皮提取物對食品中常見細(xì)菌如大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果，研究石榴皮提取物多酚含量和抗氧化活性。試驗(yàn)得出以下結(jié)論:石榴皮提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用較好，石榴皮甲醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為24.5和21.5 mm。金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度為0.250 mg/ml、大腸桿菌最小抑菌濃度為0.500 mg/ml。石榴皮提取物多酚含量為191.4 mg/g。石榴皮甲醇提取物對羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基·)和DPPH·的 IC50分別為 0.58、0.65、0.63 mg/ml。很明顯該提取物對羥自由基的清除作用最強(qiáng)。

該研究僅對石榴果皮甲醇提取物的抑菌活性進(jìn)行了研究，其他部位不同溶劑提取物仍需要進(jìn)行抑菌活性測試，以此來明確石榴其他部位的提取物抑菌活性強(qiáng)弱。同時(shí)還對提取物的抗氧化性進(jìn)行初步測定。這些有助于增進(jìn)對將來開發(fā)無害有效的新型天然防腐劑和抗氧化劑的了解，并對這些新型添加劑進(jìn)行相應(yīng)的毒理評價(jià)，應(yīng)用于食品保藏技術(shù)中，使人們食用更綠色安全、放心可靠的食品。

目前在食品中一直沿用直接在食品中添加防腐劑，但為了提高防腐劑的使用效果，將來可以改善單一的添加方式，結(jié)合新型的技術(shù)，如與物理場強(qiáng)強(qiáng)化技術(shù)相結(jié)合、采用外控氣相抑菌技術(shù)等，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)以提高食品質(zhì)量、降低加工成本、研發(fā)和利用高效多功能類型防腐劑的目標(biāo)。我國分布著許多擁有優(yōu)良石榴品種和栽培條件的種植基地，產(chǎn)量可觀［11］，石榴皮為石榴加工的下腳料，屬于農(nóng)副產(chǎn)品的廢棄物，來源廣泛，價(jià)格低廉，對環(huán)境基本不會造成污染和其他負(fù)面影響。從目前研究狀況可知，石榴皮中存在多種生物活性物質(zhì)，這些天然物質(zhì)不僅具有強(qiáng)抗氧化活性，而且在抑菌方面顯得非常出色，這些優(yōu)點(diǎn)使得其在今后的食品反腐保鮮中應(yīng)用前景廣闊。

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