蘭溪小蘿卜生產(chǎn)過程中有害微生物的初步鑒定以及巴氏滅菌的應(yīng)用工藝

童秋法，鮑銀堂，童永生

（蘭溪市桃源食品有限公司，浙江 蘭溪 321100）

1 實驗材料和儀器

1.1 實驗材料

生產(chǎn)線上抽取的小蘿卜，成品真空袋裝小蘿卜，漬液，環(huán)境取樣。

1.2 實驗試劑

乙醇，氫氧化鈉，無菌生理鹽水，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 實驗儀器

TG328A(s)分析天平，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，101-1A恒溫干燥箱，萬用電爐 （500-1000 W），鹽度計，pH-2C型數(shù)字酸度計，HH-B11-420上海躍進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱。

2 實驗方法

2.1 試驗前的準(zhǔn)備

在實驗開始前應(yīng)當(dāng)做一些相應(yīng)的準(zhǔn)備實驗。按照說明書配好馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，1 mL移液管用報紙包好，培養(yǎng)皿以10個一套用報紙包好，將蒸餾水按照9 mL每管的標(biāo)準(zhǔn)制備無菌水，制備好后10個一套用報紙包好并用滅菌鍋滅菌。

2.2 微生物的分離純化

2.2.1 微生物的取樣

在規(guī)定的環(huán)境下用棉簽蘸取少量物質(zhì)，放入事先已經(jīng)滅菌的無菌生理鹽水中。

2.2.2 微生物的分離純化

將上述生理鹽水帶入實驗室的無菌操作間中，分別取1 mL樣品溶液滴入到事先已經(jīng)滅好菌的9 mL裝的生理鹽水中成為稀釋10倍的樣品溶液。按照此法一次制備10-1，10-2，10-3濃度的菌懸液。然后分別從這3個稀釋度的菌懸液中吸取1 mL滴入裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中并且放入恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)36 h。觀察微生物生長的情況，挑選菌落比較單一的作為分離對象轉(zhuǎn)接入含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的斜面試管中，并在28℃下培養(yǎng)36 h。按照此法重復(fù)即可得到比較單一的微生物。

2.3 微生物的初步鑒定

2.3.1 微生物菌落的觀察

在培養(yǎng)皿上長成的單菌落，通過肉眼觀察菌落邊緣圓潤與否，中心突凹與否，菌落顏色，菌落氣味，生長狀態(tài)等等。

2.3.2 微生物的顯微觀察

取出浸泡在酒精里的載波片在酒精燈上燃燒掉多余的酒精，在一端滴上一滴蒸餾水備用。將上述分離純化的單一菌種用接種環(huán)挑出一點放入到載玻片一端的蒸餾水中，然后均勻的涂布到載玻片的中央，在酒精燈下固定3次即可。放到顯微鏡下利用400倍觀察微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.4 巴氏滅菌的效果測試

在殺菌過程中，溫度與時間是至關(guān)重要的兩個因素。如果殺菌溫度過低，不能殺滅有害微生物而引起變渾，變褐等不良現(xiàn)象；而溫度過高或時間過長，雖然能夠有效遏制微生物的生長，但是過高的溫度以及熱強度都會對產(chǎn)品本身造成破壞。常見的情況便是產(chǎn)品出現(xiàn)褐變加速以及失去脆度。因此要通過一系列實驗來找到既能有效殺死微生物又能保證產(chǎn)品顏色以及脆度的滅菌條件。

2.4.1 罐裝半成品巴氏滅菌的效果測定

將生產(chǎn)線上的蘿卜利用65℃滅菌5 min，10 min；70℃ ，75℃ 分 別 滅 菌 1 min，2 min，5 min；100℃滅菌 10 s，30 s，40 s，60 s。 在完成滅菌操作以后，要立即利用涼水沖洗降溫。將處理好的蘿卜樣品放到包裝車間放置1.5 h之后包裝。放入恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)10天觀察每一批產(chǎn)品的質(zhì)量變化。最后分別對不同處理的樣品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的測定，求得抑菌率。以了解不同溫度不同時間的巴氏滅菌效果以及對產(chǎn)品的影響程度。

2.4.2 袋裝成品巴氏滅菌的效果測定

由于袋裝成品的真空包裝過程中的真空包裝度不夠，因此其質(zhì)量得不到相應(yīng)的保證。主要將包裝車間出來的成品袋裝產(chǎn)品利用60℃滅菌1 min，2 min，5 min，10 min；65℃滅菌 1 min，2 min，5 min，10 min；70℃滅菌 1 min，2 min，5 min；75℃滅菌1 min，2 min，5 min；在完成滅菌操作以后，要立即利用涼水沖洗降溫。放入恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)10天觀察每一批產(chǎn)品的質(zhì)量變化。最后分別對不同處理的樣品進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的測定，求得抑菌率。以了解不同溫度不同時間的巴氏滅菌效果以及對產(chǎn)品的影響程度。

2.5 細(xì)菌總數(shù)的測定

按GB 4789.2-2010菌落總數(shù)測定中方法測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 廠區(qū)中有害菌的初步鑒定

通過對廠區(qū)個關(guān)鍵點取樣的結(jié)果來看，廠區(qū)的衛(wèi)生條件不是令人十分滿意。在發(fā)酵池中以及包裝車間中的酵母含量十分多，包裝機器上有明顯的酵母菌落。各關(guān)鍵點的取樣結(jié)果如表1。

由表1我們可以看出在整個生產(chǎn)車間的各個環(huán)節(jié)中都充滿了酵母菌。由菌落形態(tài)和顯微鏡下的菌體形態(tài)觀察可以初步鑒定在整個生產(chǎn)環(huán)節(jié)中主要由三種酵母菌的存在。主要是膠紅酵母，產(chǎn)膜酵母以及釀酒酵母。其中主要影響小蘿卜產(chǎn)品品質(zhì)的是產(chǎn)膜酵母以及釀酒酵母。產(chǎn)膜酵母在醬油制品以及酒類制品中都是影響其產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。其表象特征主要是在生長過程中產(chǎn)生大量的氣泡，然后在液體表面產(chǎn)生一層皺皺的膜狀物質(zhì)，從而影響產(chǎn)品的感觀感受和品質(zhì)。而釀酒酵母則多用于葡萄酒的釀制過程中，由于其在生長過程中產(chǎn)生大量的酒精而得名。也正是由于其在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生酒精，抑制蘿卜腌制過程中乳酸菌得生長，因而對蘿卜產(chǎn)品的品質(zhì)造成很大得影響。膠紅酵母雖然在自身生長過程中不會產(chǎn)生一些不利于產(chǎn)品品質(zhì)的物質(zhì)，但是試驗發(fā)現(xiàn)在整個生產(chǎn)過程中，酵母菌的含量始終是大于蘿卜發(fā)酵的生產(chǎn)菌種——乳酸菌。因此膠紅酵母在自身生長過程中可能會由于生長過旺而影響乳酸菌的生長。

工藝環(huán)節(jié) 取樣點 菌落形態(tài) 氣味 顏色 菌體形態(tài)發(fā)酵池 鹽胚 外周圓滑，中間突起，菌落大 無味 乳白 球狀，明顯出芽生殖現(xiàn)象發(fā)酵池 鹽胚 外周圓滑，中間突起，菌落小 酒味 乳白 橢球狀，有出芽生殖現(xiàn)象發(fā)酵池 脫鹽 外周圓滑，中間突起，菌落大 無味 乳白 球狀，有出芽生殖現(xiàn)象分揀 排水溝 外周圓滑，中間突起，菌落大 無味 紅色 橢球狀，有出芽生殖現(xiàn)象分揀 臺面 外周圓滑，中間突起，有黏液 無味 乳白 橢球狀，有出芽生殖現(xiàn)象包裝 機器 外周圓滑，中間突起，菌落大 無味 乳白 球狀，有出芽生殖現(xiàn)象

綜上所述，在整個生產(chǎn)過程中影響產(chǎn)品品質(zhì)的一個重要原因就是酵母菌的存在。因此在整個生產(chǎn)工藝中有效地控制酵母菌的生長是必要的。而要想控制酵母菌的生長，首先要做到衛(wèi)生條件要好，其次采用一些殺菌方式來有效地遏制產(chǎn)品在變?yōu)樯唐分蟮馁|(zhì)量問題。

3.2 巴氏滅菌的效果測試

3.3 巴氏滅菌對半成品的殺菌效果測試

由于包裝材料的限制，罐裝蘿卜不能進(jìn)行包裝后的成品滅菌，因此只能進(jìn)行半成品的滅菌試驗。將脫鹽的蘿卜放入不同溫度的水浴鍋里浸泡不同的時間，然后放回包裝車間進(jìn)行包裝之后按照固定溫度培養(yǎng)10天觀察效果。其結(jié)果如表2。

表2 罐裝半成品產(chǎn)品巴氏殺菌以后（顏色/渾濁）觀察結(jié)果

從上表可以看出所有經(jīng)過巴氏殺菌的樣品，在28℃下存放5天均未出現(xiàn)明顯的褐變以及渾濁的現(xiàn)象。但是第6天開始便有不同現(xiàn)象發(fā)生。同時實驗發(fā)現(xiàn)在加熱以后，產(chǎn)品都有不同程度的氣脹現(xiàn)象。當(dāng)加熱時間大于5 min的時候，樣品在第6天明顯在色澤上出現(xiàn)問題。主要的問題是產(chǎn)品變黑，發(fā)黃。分析其原因主要是因為長時間高溫處理使得蘿卜組織受到破壞，使色氨酸、羥脯氨酸、組氨酸、賴氨酸、天門冬氨酸游離出來與糖類物質(zhì)發(fā)生美拉反應(yīng)導(dǎo)致變黑。當(dāng)溫度大于70℃時，產(chǎn)品在第6天出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象，而且在70℃處理5 min以及在75℃下處理2 min時樣品渾濁效果越發(fā)明顯。分析原因可能是因為此溫度與時間還不足以將酵母菌完全殺死，然而加熱所產(chǎn)生的氣脹現(xiàn)象又使得瓶裝產(chǎn)品內(nèi)的空氣大量增加。在此環(huán)境下，為酵母菌的生長造成了非常好的環(huán)境，因而使得產(chǎn)品的感觀效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)差于其他處理的產(chǎn)品。同時，實驗也發(fā)現(xiàn)利用高溫瞬時殺菌的效果與傳統(tǒng)的巴氏殺菌方法相比不僅在色澤上沒有太大的變化而且在防止渾濁的效果上也非常好。由上表可以看出100℃溫度處理的樣品大多數(shù)都能較長時間的保存，而且其顏色與色澤都與對照產(chǎn)品差別不大。

本實驗同時還對巴氏殺菌半成品的滅菌效果以及產(chǎn)品其他的感觀性質(zhì)做了評價。其具體結(jié)果如表3。

表3 巴氏殺菌半成品的滅菌效果以及產(chǎn)品其他的感觀性質(zhì)評價

從感觀評價來說，所作處理對于產(chǎn)品的風(fēng)味以及口感上的影響基本上很小。同時也發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱溫度高于70℃時，溫度對產(chǎn)品口感上的影響要逐漸增大。而時間上，當(dāng)溫度低于70℃時，加熱時間不超過5 min基本上不會對口感以及風(fēng)味有太大的影響。其直觀表現(xiàn)為有些樣品在20℃條件下存放到6天之后便出現(xiàn)湯汁渾濁的現(xiàn)象。由下表可以看出當(dāng)產(chǎn)品中的酵母細(xì)菌總數(shù)能夠控制在102以下（即抑菌率在99.99%）的時候能夠較好的保證產(chǎn)品汁液的渾濁度。而從上表中我們看到當(dāng)溫度在70℃以下時，其抑菌的效果不是特別理想，當(dāng)加熱時間延長時雖然能夠達(dá)到抑制酵母生長的效果但是長時間的高溫處理使得產(chǎn)品的顏色以及口感都得不到很好的保證。而當(dāng)溫度在70℃以上的時候，雖然殺菌效果非常明顯但是由于溫度的影響使得產(chǎn)品的脹氣現(xiàn)象比較明顯。由于產(chǎn)品出現(xiàn)脹氣現(xiàn)象使得在包裝后的空間中產(chǎn)生了大量的氧氣使得酵母能夠再次繁殖從而使抑菌效果大打折扣。所以當(dāng)采用70℃以上的溫度滅菌時，應(yīng)當(dāng)注意采用較短的加熱時間來對產(chǎn)品進(jìn)行處理。實驗研究發(fā)現(xiàn)在70℃以上的溫度條件下，加熱時間不要超過1min時是比較理想的結(jié)果。同時實驗采用100℃的高溫對樣品處理取得了比較理想的結(jié)果。其通過100℃殺菌的樣品通過實驗表明能夠在28℃的條件下存放至少10天，而這種效果是通過其他溫度殺菌所達(dá)不到的。

圖1 各產(chǎn)品酵母對數(shù)比較

3.4 成品袋裝產(chǎn)品巴氏殺菌效果

將生產(chǎn)車間中包裝好的袋裝成品放入水浴鍋中分別以 60℃，65℃處理 1 min，2 min，5 min，10 min； 70℃，75℃的溫度處理 1 min，2 min，5 min。然后冷水沖淋至冷卻，做好標(biāo)記放入恒溫培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，分別從蘿卜的顏色，料液的渾濁度跟蹤觀察10天，最后打開產(chǎn)品，測試產(chǎn)品的脆度。

在恒溫培養(yǎng)箱中跟蹤觀察的結(jié)果如表4

表4 成品袋裝產(chǎn)品巴氏殺菌以后（顏色/渾濁）觀察結(jié)果

從上表能夠清楚的看到在袋裝產(chǎn)品的殺菌方面，其效果遠(yuǎn)不如罐裝的效果好。當(dāng)溫度高于70℃時，整個滅菌樣品袋或多或少的出現(xiàn)了渾濁的現(xiàn)象。并且伴有大量的氣泡產(chǎn)生。實驗表明，利用70℃以下滅菌至少需要5 min左右才能獲非常好的結(jié)果。同時在蘿卜感觀上的變化影響不是十分的明顯。相比較而言，袋裝產(chǎn)品對溫度的敏感性要比瓶裝的大得多。應(yīng)當(dāng)說在60-65℃的溫度條件下進(jìn)行殺菌是可行的。

本實驗同時還對巴氏殺菌袋裝成品的滅菌效果以及產(chǎn)品其他的感觀性質(zhì)做了評價。其具體結(jié)果如表5。

從感官評價上來說,當(dāng)加熱時間不大于5 min的時候?qū)τ诨j卜顏色的影響很小,而大于5 min時顏色會發(fā)生明顯的變化。但是從殺菌效果上來說，當(dāng)加熱時間達(dá)到10 min時基本上能夠達(dá)到滅菌的效果。在任何溫度下加熱到10 min的時候，其酵母含量只有一個數(shù)量級。從存放效果上來說也存在與實驗結(jié)果相類似的結(jié)果。同時實驗發(fā)現(xiàn)加熱溫度在70℃以上時，脹氣現(xiàn)象同樣十分明顯。相比于罐裝半成品而言這種脹氣現(xiàn)象對于產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響要大得多。對于溫度較高（高于70℃）時，加熱時間短不適用于袋裝半成品的殺菌過程。最好還是采用低溫長時間加熱或者是高溫5 min加熱的方式。由圖可知當(dāng)抑菌率達(dá)到99%以上時基本上能夠解決產(chǎn)品的渾濁現(xiàn)象。試驗表明在滅菌率高于99%時，樣品在28℃下至少能夠存放9天左右。

圖2 各產(chǎn)品酵母對數(shù)比較

3.5 成品袋裝產(chǎn)品其他殺菌方式效果

本實驗處了完成巴氏殺菌的方式外，還對樣品進(jìn)行了紫外，微波殺菌的效果測試。其效果見表6

通過上述實驗可以發(fā)現(xiàn)，紫外和微波的殺菌方式不能十分有效的殺死樣品中的酵母菌。但是微波和紫外殺菌的方式都不會使產(chǎn)品發(fā)生脹氣現(xiàn)象。應(yīng)當(dāng)說其對產(chǎn)品的感觀效果是很好的。建議在采用巴氏殺菌方式的同時能夠結(jié)合使用紫外殺菌的方式，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時對于產(chǎn)品中的酵母也能起到非常好的抑制作用。

表5 巴氏殺菌成品袋裝的滅菌效果以及產(chǎn)品其他的感觀性質(zhì)評價

表6 其他殺菌方式對于成品袋裝的滅菌效果以及產(chǎn)品其他的感觀性質(zhì)評價

4 建議

1)采用巴氏殺菌與紫外殺菌相結(jié)合的方式對其進(jìn)行處理，具體方式為70℃左右滅菌2-5 min，然后紫外滅菌5 min，這樣基本上能夠達(dá)到殺菌的效果。

2)產(chǎn)品滅菌只是從包裝環(huán)節(jié)抑制酵母的生長來解決產(chǎn)品出現(xiàn)的品質(zhì)問題。而要想真正從根本上解決問題還是需要從發(fā)酵環(huán)節(jié)來解決。

[1]黃洪明．蘭溪小蘿卜的特征特性及生產(chǎn)技術(shù)[J]．浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（6）：314-315．

[2]李學(xué)貴．對蘿卜干腌制工藝的探討[J]．中國釀造，2005（7）：39-42．

[3]施安輝．蔬菜傳統(tǒng)腌制發(fā)酵工藝過程中微生物生態(tài)學(xué)的意義[J]．中國調(diào)味品，2005（5）：11-15．

[4]吳錦濤．延長泡菜和酸菜保質(zhì)期的研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，1999（3）：39-42．

[5]李煥榮．泡菜貯藏期間品質(zhì)變化規(guī)律的研究[J]．食品科技，2004（9）：28-31．

[6]周曉媛．蔬菜腌制品的風(fēng)味研究進(jìn)展[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2004（4）：104-108．

[7]張?zhí)m威．酸菜發(fā)酵與貯藏期間發(fā)生變色的機理研究[J]．科研開發(fā)，1997（3）：11．

[8]雷紅．腌漬幼瓜的脆度研究[J]．中國調(diào)味品，2002（11）：19-22．

[9]張懷珠．泡菜腌制方法及管理要點[J]．農(nóng)業(yè)科技通信，2002（11）：11-12．

[10]高瓊．蘭溪小蘿卜在腌制過程中品質(zhì)變化規(guī)律的研究[J]．中國調(diào)味品，2007（6）：33-35．