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    D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶及其應(yīng)用

    2014-12-20 08:38:56王瓊王遠(yuǎn)山
    發(fā)酵科技通訊 2014年3期
    關(guān)鍵詞:利用生產(chǎn)

    王瓊,王遠(yuǎn)山

    (浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所,浙江 杭州 310000)

    1 前言

    稀有糖是常見單糖(如半乳糖、葡萄糖等)分子中至少一個羥基被氫原子或其他基團(tuán)所取代而形成的化合物[1]。據(jù)推測,在自然界中約有50種稀有糖,至今已發(fā)現(xiàn)34種,D-型稀有糖與L-型稀有糖各占一半[2]。其中D-塔格糖、D-阿洛酮糖、D-阿洛糖、L-系列糖和木糖醇等稀有糖具有及其良好的理化性質(zhì)及活性功能(表1),廣泛應(yīng)用于甜味劑、醫(yī)藥中間體和保健食品體的生產(chǎn)等領(lǐng)域[2]。目前稀有糖的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?;瘜W(xué)合成法涉及到催化加氫、加成反應(yīng)、Ferrier重排等反應(yīng),其中關(guān)環(huán)轉(zhuǎn)換合成法和兩步合成法是具有一定競爭力的方法。但這些方法反應(yīng)存在著反應(yīng)步驟多、需保護(hù)和脫保護(hù)、條件苛刻、產(chǎn)率較低和副產(chǎn)物多等不足,還需要改進(jìn)和完善。近年來,以差向異構(gòu)酶為基礎(chǔ)的稀有糖生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)由于其良好的立體選擇性、溫和的反應(yīng)條件等優(yōu)點(diǎn)而日益受到重視[1-2]。

    差向異構(gòu)酶,又稱變旋酶,是催化單糖分子中某一個不對稱碳原子的構(gòu)型變化的酶。目前報(bào)道的可應(yīng)用于稀有糖大規(guī)模生產(chǎn)的差向異構(gòu)酶,僅有 D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶 (D-tagatose 3-epimerase,DTEase)和D-阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase)。

    近年來,利用廉價(jià)單糖為原料,通過差向異構(gòu)酶實(shí)現(xiàn)己酮糖C-3位置間的差向異構(gòu)反應(yīng)制備稀有糖,已成為生化工程領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。本文主要介紹了DTE酶家族成員DTEase和DPEase的來源、酶學(xué)特性、蛋白結(jié)構(gòu)以及DTE酶家族在稀有糖生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀等,最后展望了DTE酶家族未來的發(fā)展方向。

    表1 常見稀有糖及其生物學(xué)功能

    2 DTE酶家族

    2.1 DTE酶家族成員的來源

    二十世紀(jì)九十年代,日本Izumori團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了來源于菊芋假單胞菌 (Pseudomonas cichorii ST-24)中的一種酶可催化D-山梨糖(D-sorbose)和D-塔格糖之間的差向異構(gòu)反應(yīng)[6],因其最適底物為塔格糖,將其命名為D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶(DTEase)。2006年,韓國Oh團(tuán)隊(duì)成功克隆表達(dá)了根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)中的DTEase基因,由于該酶對D-阿洛酮糖有較強(qiáng)的底物特異性,后將其更名為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶[7](DPEase)。 DTEase和 DPEase可催化相似系列的反應(yīng),即單糖C-3位置的差向異構(gòu)反應(yīng),因此共同構(gòu)成了一個新家族—DTE酶家族。至今為止,已先后在類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides SK011)[8]、 梭狀芽胞桿菌(Clostridium cellulolyticum H10)[9]、瘤胃球菌(Ruminococcus sp.)[10]和 Desmospora sp.[11]中發(fā)現(xiàn)了新的 DTE 酶家族成員,如表2所示。

    2.2 DTE酶家族的酶學(xué)特性

    DTEase和DPEase雖催化相同系列的反應(yīng),但因來源不同,兩者的最適pH、最適溫度、半衰期、底物特異性等生化特性存在較大差異,表3列出了不同DTE酶家族成員的生化特性。據(jù)表3可知,DTE家族酶適宜中性或弱堿性環(huán)境;與其它來源的DTEase相比,R.sphaeroides的DTEase耐熱性最差;而C.cellulolyticum中的DPEase半衰期明顯比其他來源的DPEase的半衰期長,具有更好的穩(wěn)定性;A.tumefaciens的DPEase的米氏常數(shù)Km值最小,對D-果糖的親和力最強(qiáng);在D-果糖與D-阿洛酮糖的差向異構(gòu)反應(yīng)中6種酶表現(xiàn)出不同的平衡比,具體見表3所示。

    表2 DTE酶家族成員的來源

    2.3DTEase和DPEase的結(jié)構(gòu)

    為闡明DTE酶家族的催化機(jī)制,Kim和Yoshida先后利用X射線衍射技術(shù)解析了DPEase和DTEase的蛋白晶體結(jié)構(gòu)[14-15]。

    表3 DTE家族酶的酶學(xué)特性

    2.3.1 A.tumefaciens DPEase晶體結(jié)構(gòu)

    圖1 DPEase的分子結(jié)構(gòu)

    Kim[14]對DPEase蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析表明,A.tumefaciens DPEase是由A、B、C和D 4個相同的亞基構(gòu)成的四聚體分子,見圖1(a)。圖1(a)標(biāo)出的2個黑點(diǎn)為推測的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。每個亞基包含8個β折疊和12個α螺旋,而8個β折疊簇被12個α螺旋緊緊環(huán)繞,整體呈TIM-桶結(jié)構(gòu),見圖1(b)。該酶為金屬離子依賴型酶,金屬離子與 Glu150、Asp183、His209 和 Glu244 結(jié)合構(gòu)成活性中心,進(jìn)行酶催化反應(yīng)。Zhang等[17]報(bào)道Desmospora sp.的DPEase添加Co2+后熱穩(wěn)定性顯著提高。

    圖2 DTEase(a)與 DPEase(b)的分子結(jié)構(gòu)

    圖3 DTEase的分子結(jié)構(gòu):(a)二聚體結(jié)構(gòu)(b)單體結(jié)構(gòu)

    2.3.2 P.cichorii DTEase晶體結(jié)構(gòu)

    Yoshida[15]對 P.cichorii DTEase蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析表明,該酶與A.tumefaciens DPEase的晶體結(jié)構(gòu)相似,由Mol-A、Mol-B、Mol-C和 Mol-D組成(圖2)。圖3(a)顯示兩個對稱的Mol-A和Mol-B亞基構(gòu)成的二聚體分子。每個亞基包含11個α螺旋和8個β折疊,整體呈現(xiàn)(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu),如圖 3(b)所示。

    3 DTE酶家族在稀有糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

    2006年,Izumori團(tuán)隊(duì)報(bào)道了利用DTE家族酶催化8種己酮糖C-3位置的差向異構(gòu)反應(yīng)[16]。圖4列出了利用DTEase在D-果糖與D-阿洛酮糖、D-塔格糖與D-山梨糖、L-果糖與L-阿洛酮糖、L-塔格糖與L-山梨糖之間的差向異構(gòu)反應(yīng)。除了D-果糖,其余7種己酮糖均為稀有糖[2]。

    圖4 DTEase催化己酮糖間的差向異構(gòu)化反應(yīng)

    隨后,Izumori等[16]又提出了利用D-塔格糖-3-差向異構(gòu)酶、醛糖異構(gòu)酶、醛糖還原酶、氧化還原酶(polyol dehydrogenase,PDH)制備各種稀有糖的Izumoring方法(圖5),使得稀有糖的相互轉(zhuǎn)化形成了一個循環(huán)網(wǎng)絡(luò),對稀有糖的生產(chǎn)具有極其重要的意義。

    圖5 丁糖、戊糖和己糖類稀有糖的生物酶法轉(zhuǎn)化

    3.1 DTE酶家族在D-阿洛酮糖制備中的應(yīng)用進(jìn)展

    目前,催化D-果糖制備D-阿洛酮糖所利用的酶主要是DTE酶家族的DPEase和DTEase。

    2008年,Kim等[17]發(fā)現(xiàn)利用DTEase轉(zhuǎn)化果糖制備阿洛酮糖的過程中,添加適量的硼酸鹽可以改變原有的化學(xué)平衡。因硼酸鹽與阿洛酮糖的親和作用較強(qiáng),促使反應(yīng)平衡沿著產(chǎn)物阿洛酮糖方向轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)64%,相比不添加硼酸鹽轉(zhuǎn)化率提高了近兩倍。2009年,Lim等[18]通過固定化含有硼酸鹽的A.tumefaciens DPEase大規(guī)模生產(chǎn)D-阿洛酮糖,該固定化酶催化700 g/L的D-果糖時(shí),D-阿洛酮糖的產(chǎn)量可達(dá)441 g/L。2011年,Mu等[19]報(bào)道了利用在大腸桿菌中過量表達(dá)的梭狀芽胞桿菌DPEase催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖,最終產(chǎn)量可達(dá)218 g/L。2013年,Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)來源于DTE酶家族新成員Desmospora sp.8437中的DPEase與Co2+離子結(jié)合后表現(xiàn)出最高酶活,催化500 g/L的D-果糖時(shí)D-阿洛酮糖產(chǎn)量達(dá)142.5 g/L。目前文獻(xiàn)報(bào)道的DTE酶家族催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的催化反應(yīng)多在堿性緩沖液中進(jìn)行,但是在該條件下會產(chǎn)生褐變,同時(shí)導(dǎo)致副產(chǎn)物的產(chǎn)生[12]。2014年,Jia等[12]報(bào)道了利用異源表達(dá)的C.bolteae DPEase在中性緩沖液條件下制備D-阿洛酮糖,轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.8%。

    3.2 DTE酶家族在稀有支鏈單糖制備中的應(yīng)用

    隨著研究的深入開展,研究人員發(fā)現(xiàn)DTE酶家族是一種底物譜相對廣泛的酶,可以催化稀有支鏈單糖的差向異構(gòu)反應(yīng)。

    Rao等[20]報(bào)道了利用DTEase催化4-甲基-L-核酮糖(4-C-methyl-L-ribulose)與 4-甲基-L-木酮糖(4-C-methyl-L-xylulose)、4-甲基-D-核酮糖(4-C-methyl-D-ribulose)與 4-甲基-D-木酮糖之間(4-C-methyl-D-xylulose)之間的差向異構(gòu)化反應(yīng),見圖6。

    圖6 DTEase催化4-C-甲基-戊糖的差向異構(gòu)反應(yīng)

    4 展望

    自從Izumori團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)DTEase并借助Izumoring策略成功地實(shí)現(xiàn)所有稀有糖的相互轉(zhuǎn)化以來,利用差向異構(gòu)酶制備各種功能性稀有糖就成為研究熱點(diǎn),研究集中在新的產(chǎn)酶菌株的篩選、催化機(jī)理、酶分離純化、酶固定化等方面。目前已取得了一定進(jìn)展,為阿洛酮糖等功能性稀有糖的生產(chǎn)提供了一條具有原子經(jīng)濟(jì)性和更綠色的途徑。

    為促進(jìn)差向異構(gòu)酶法生產(chǎn)功能性稀有糖的研究和產(chǎn)業(yè)化開發(fā),目前仍需在以下方面需加大研究力度:(1)DTE酶家族成員資源的拓展,目前僅有來源于6種菌株中的DTEase和DPEase被確定為DTE家族成員,在底物譜等方面存在著差異。因此,獲得新的DTE家族酶將為酶法制備稀有糖的研究提供基礎(chǔ)。(2)差向異構(gòu)酶催化機(jī)理的研究,目前對其催化機(jī)理研究還處于初步的階段,對酶的結(jié)構(gòu)與催化功能、立體選擇性的關(guān)系等尚待深化;(3)差向異構(gòu)酶催化性能提升,現(xiàn)有的酶的熱穩(wěn)定性、底物特異性等還存在著一些不足,可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行分子改造以提高催化性能、拓寬底物譜;(4)差向異構(gòu)酶應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,要進(jìn)一步利用其底物特異性,嘗試DTE家族在新型的支鏈稀有糖生產(chǎn)中的應(yīng)用,以實(shí)現(xiàn)功能性稀有糖的高效和綠色生產(chǎn)。

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