利用電子自旋共振技術(shù)研究海參提取液體外抗氧化活性

奚 倩 趙雅娉 張警予 董秀芳 李 楠 劉 麗 啟 航（.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 604；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 8400；.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司技術(shù)研發(fā)中心，遼寧 大連 6000）

海參屬無脊椎動物棘皮動物（Echinodermata），海參綱（Holothuroidea）［1］，是海洋中重要的食物和藥物資源。海參具有高蛋白、低脂肪的特點，具有多種人體所需的微量元素，并含有酸性粘多糖、皂苷及糖脂等特殊成分，不僅對人體有營養(yǎng)、滋補作用，而且還具備抗氧化，延緩衰老的保健功效［2］。2012年，中國海參產(chǎn)量達到了17.1萬t［3］，居世界第一位，為開發(fā)營養(yǎng)健康的海參食品提供了良好的資源基礎(chǔ)。自由基是指外層軌道上含有未成對電子的分子，化學(xué)性質(zhì)活潑，能夠氧化細胞及機體的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)，進而引起慢性疾病和與年齡相關(guān)的退化性疾?。?］。

由于海參制備的相關(guān)物質(zhì)具有較好的抗氧化活性，王靜等［5］利用海參機體自溶制備了4種不同分子量范圍的海參多肽，發(fā)現(xiàn)對羥基自由基、超氧陰離子和過氧化氫均有清除效果，并強于天然抗氧化劑Vc。許靜等［6］發(fā)現(xiàn)海參臟器多糖HPS1、HPS2在體外具有一定清除羥基自由基、超氧陰離子和DPPH的作用，且呈一定的量效關(guān)系。鄭杰等［7］利用海參自溶技術(shù)制備海參腸自溶水解物，發(fā)現(xiàn)其具有一定的DPPH清除能力、Fe2＋螯合能力和還原能力。這些結(jié)果都是采用傳統(tǒng)的化學(xué)分析法，檢測靈敏度低，樣品消耗量大，檢測效率不高。

電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）又稱電子順磁共振，是在磁場中測量未成對的電子［8］，可以探測和識別具有未成對電子的分子，是檢測自由基最直接有效的方法［9］，其檢測靈敏度高，樣品消耗量小，效率較高。ESR技術(shù)是近年來在食品領(lǐng)域新興的一種檢測技術(shù)，但在水產(chǎn)品生理活性，物質(zhì)活性分析方面的應(yīng)用罕見。海參提取液是對海參體內(nèi)物質(zhì)的有效提取溶液，對海參提取液的體外活性研究可以很好地間接反應(yīng)海參的功能活性。應(yīng)用ESR技術(shù)研究海參提取液的抗氧化活性國內(nèi)外未見報道，本研究擬以海參為原料分別制備海參腸和體壁的提取液，并應(yīng)用ESR技術(shù)分別檢測兩種提取液對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的體外清除作用，以期拓展ESR技術(shù)在水產(chǎn)品加工貯藏及生理活性物質(zhì)領(lǐng)域的應(yīng)用，旨在為開發(fā)具有抗氧化功能的海參食品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮海參（Stichopus japonicas）：購于大連市長興水產(chǎn)品市場；

DPPH、嘌呤氧化酶：美國Sigma－Aldrich公司；

次黃嘌呤、EDTANa2：生工生物工程（上海）股份有限公司；

二甲基吡咯啉氮氧化物（DMPO）、二乙胺三胺五乙酸（DETAPAC）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；

其余試劑：均為分析純試劑。

1.2 儀器

電子順磁共振波譜儀：A200型，德國Bruker Opertics公司；

酶標儀：M200型，瑞士Tecan Infinite公司；

冷凍離心機：RC－6plus型，美國Virtis公司；

電熱恒溫干燥箱：XMT－152A型，上海躍進醫(yī)療器械廠；

精密pH計：PHS 3C，上海雷磁儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海參腸和體壁提取液的制備 新鮮的海參解剖后分離出腸和體壁，分別按1∶2（m∶V）的比例加入150mM的磷酸鹽緩沖液，研磨，10 000r/min離心10min，得上清液，備用，所有操作都在4℃下完成。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍 G－250法［10］。

1.3.3 海參提取液清除DPPH自由基活性測定 500μM的DPPH 20μL，pH 6.0，100mM磷酸鹽緩沖液20μL，各濃度提取液10μL，迅速混合，避光保存30min，立即吸入毛細管，放入諧振腔，在中心磁場強度3 368.6G；微波功率5.32mW；微波頻率9.44GHz；放大倍數(shù)1.42×104；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時間常數(shù)81.92ms；轉(zhuǎn)換時間40ms條件下掃描。用抗壞血酸（Vc）為陽性對照，空白組中提取液用pH 6.0，100mM磷酸鹽緩沖液代替，以波譜信號第3個峰高值表示信號的相對強度，按式（1）計算清除率［11］：

1.3.4 海參提取液清除羥基自由基活性測定 在Fenton反應(yīng)體系中，6mM 的EDTANa210μL，6mM的FeSO410μL，6%H2O28μL，1MDMPO 10μL，各濃度提取液10μL，用pH 7.4、150mM磷酸鹽緩沖液補充體積至100μL，混合均勻后，40℃水浴30min后，立即吸入毛細管，放入諧振腔，在中心磁場強度3 369.08G；微波功率74.8mW；微波頻率9.44GHz；放大倍數(shù)1.00×105；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時間常數(shù)163.84ms；轉(zhuǎn)換時間160ms條件下掃描。用甘露醇作為陽性對照，空白組中提取液用p H 7.4、1 50mM磷酸鹽緩沖液代替，以波譜信號第2個峰高值表示信號的相對強度［12］，按式（1）計算清除率。

1.3.5 海參提取液清除超氧陰離子活性測定 在次黃嘌呤—黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生·的反應(yīng)體系中，取5mM的次黃嘌呤（HPx）5μL，0.7U/mL 黃嘌呤氧化酶（XOD）1μL，1 0mM DETAPAC 5μL，1MDMPO 7.5μL，各濃度提取液1 0μL，用pH 7.4 50mM磷酸鹽緩沖液補充總體積到5 0μL，立即吸入毛細管，放入諧振腔，在中心磁場強度3 367.87G；微波功率1.17mW；微波頻率9.438GHz；放大倍數(shù)5.02×105；調(diào)制幅度1.0G；調(diào)制頻率100kHz；時間常數(shù)2 621.44ms；轉(zhuǎn)換時間480ms條件下掃描。用抗壞血酸（Vc）作為陽性對照，空白組中提取液用pH 7.4、50mM磷酸鹽緩沖液代替，以波譜信號第1個峰高值表示信號的相對強度［13］，按式（1）計算清除率。

1.3.6 統(tǒng)計分析方法 用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用單向方差分析，P＜0.05被認為是顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 海參腸和體壁提取液對DPPH的清除作用

DPPH是一種含有不對稱價電子的氮族自由基，自由基清除劑能使DPPH的單電子配對，減弱ESR的信號強度（峰高），常用此來衡量抗氧化劑的抗氧化活性［14］。本研究采用ESR技術(shù)分別檢測不同蛋白濃度的海參腸提取液和體壁提取液對DPPH的清除作用，結(jié)果見圖1。由圖1可知，海參腸提取液和體壁提取液都具有一定清除DPPH的作用，并且隨著濃度的升高，峰高逐漸降低，清除作用增大（P＜0.05）。海參腸和體壁提取液對DPPH清除能力的IC50值分別為0.91μg/mL和1.29μg/mL，高 于 Vc對 DPPH 的 清 除 能 力 （IC50＝6 2.15μg/mL）。對于相同濃度的海參腸和體壁提取液，海參腸提取對DPPH的清除能力大于體壁提取液，在2μg/mL濃度時，清除率分別為（91.85±0.11）%和（80.62±0.08）%。高于肖月娟等［15］的研究結(jié)果（斑鰶魚蛋白酶解物在蛋白質(zhì)量濃度為5mg/mL的條件下，DPPH清除率為78.26%）。

圖1 海參腸和體壁提取液對DPPH的清除作用Figure 1 The scavenging effect of sea cucumber gut and body wall extracts on DPPH

2.2 海參腸和體壁提取液對羥基自由基的清除作用

Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生的羥基自由基被DMPO捕捉后形成比較穩(wěn)定的DMPO—OH加合物，有利于ESR的檢測［16，17］。本研究各樣品經(jīng)ESR檢測到典型的峰高為1∶2∶2∶1的加合物特征峰。由圖2可知，羥基自由基的ESR信號強度（峰高）隨著濃度的增大而減小，海參腸和體壁提取液對羥基自由基的清除效果顯著增強（P＜0.05）。海參腸和體壁提取液對羥基自由基清除能力的IC50值分別為0.006，0.52μg/mL，與對照甘露醇（IC50為26.97mg/mL）和王蒞莎等［18］報道的從皺紋盤鮑臟器中提取鮑魚臟器粗多糖對羥基自由基的清除率（IC50為0.99mg/mL）相比，其抗氧化活性更強。在0.02μg/mL濃度時，海參腸提取液對羥基自由基的清除率為（99.49±0.17）%，遠高于體壁提取液的清除率（38.67±4.13）%。

圖2 海參腸和體壁提取液對羥基自由基的清除作用Figure 2 The scavenging effect of sea cucumber gut and body wall extracts on hydroxyl radical

2.3 海參腸和體壁提取液對超氧陰離子的清除作用

圖3 海參腸和體壁提取液對超氧陰離子的清除作用Figure 3 The scavenging effect of sea cucumber gut and body wall extracts on superoxide anion

3 結(jié)論

海參腸與體壁提取液對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子都具有很好的清除作用，說明海參是很好的抗氧化食品，ESR技術(shù)是研究海參體外抗氧化活性的一種重要分析手段。本研究為開發(fā)海參抗氧化食品提供了一定的理論依據(jù)，同時拓展了ESR技術(shù)在水產(chǎn)品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。下一步將對海參的抗氧化分子組分及其對脂質(zhì)類自由基的清除作用開展研究。

1 廖玉麟.中國動物志·棘皮動物門·海參綱［M］.北京：商務(wù)印書館，1997.

2 樊繪曾.海參：海中人參—關(guān)于海參及其成分保健醫(yī)療功能的研究與開發(fā)［J］.中國海洋藥物，2001，20（4）：37～44.

3 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒［Z］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

4 Audrey M F，Mogens L A，Laura N.Ascorbic acid induced degradation of beta－glucan：Hydroxyl radicals as intermediates studied by spin trapping and electron spin resonance spectroscopy［J］.Carbohydrate Polymers，2012，87（3）：2 160～2 168

5 王靜，張京樓，王鐸喜，等.海參多肽的抗氧化性能研究［J］.食品與機械，2010，26（2）：67～71.

6 許靜，解秋菊.海參臟器多糖體外抗氧化活性研究［J］.食品研究與開發(fā)，2011，32（12）：29～31.

7 鄭杰，吳海濤，朱蓓薇，等.海參腸自溶水解物抗氧化活性的研究［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，30（5）：314～317.

8 趙保路.電子自旋共振（ESR）技術(shù)在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.波普學(xué)雜志，2010，27（1）：51～67.

9 Eva F，Joaquin V，Marit A，et al.Detection of radical development by ESR spectroscopy techniques for assessment of oxidative susceptibility of fish oils［J］.Agriculture Food Chemistry，2005，221（5）：667～674.

10 Marion M B.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram of protein utilizing the principle of protein－dye binding ［J］.Analytical Biochemistry，1976，72（1～2）：2 48～254.

11 騰楊，王雪，杜波濤，等.金銀花的不同濃度醇提取物對DPPH清除作用的 ESR研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（6）：43～44.

12 張友九，寧萍，強亦忠，等.水溶性抗氧化劑清除羥基自由基能力的ESR 評價方法［J］.蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，21（1）：32～34.

13 陳海光，曾慶孝.荷葉功能成分的提取及其對自由基清除作用的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（10）：34～38.

14 胡建，李哲進，孔凡偉，等.順磁共振法測定牛蒡純化多糖的DPPH自由基清除率［J］.安徽農(nóng)業(yè)科技，2012，40（21）：1 0 821～10 825.

15 肖月娟，李潤豐，鄭立紅，等.斑鰶魚蛋白控制酶解及酶解物抗氧化活性研究［J］.中國食品學(xué)報，2010，10（5）：91～96.

16 曾慶祝，許慶陵，林魯萍，等.扇貝邊活性肽的分離及其對羥基自由基的清除活性研究［J］.中國食品學(xué)報，2004，4（3）：10～14.

17 Lee S J，Cheong S H，Kim Y S，et al.Antioxidiant activity of a novel synthetic hexa－peptide derived from an enzymatic hydrolysate of duck skin by－products［J］.Food and Chemical Toxicology，2013（62）：276～280.

18 王蒞莎，朱蓓薇，周大勇，等.鮑魚臟器多糖的抗氧化活性研究［J］.食品與機械，2008，24（4）：65～68.

19 沈生榮，楊腎強，趙保路，等.茶多酚復(fù)合體及L－EGCG清除超氧陰離子自由基特性的研究［J］.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，18（4）：11～16.