刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝優(yōu)化

劉 婷 歐陽夢云 王 燕 吳 佳 李 凱 劉賓翰

(1.湖南農業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙 410128;2.湖南農業(yè)大學東方科技學院，湖南長沙 410128)

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，具有酚和芪的特性，無味，白色針狀晶體，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮等有機溶劑。天然白藜蘆醇有順、反兩種結構，自然界中主要以反式構象(生理活性強于順式異構體)存在，且兩種結構都可與葡萄糖結合，分別形成順式和反式白藜蘆醇糖苷［1］。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗炎、抗過敏、抗病原微生物［2］、誘導腫瘤細胞凋亡［3］、提高免疫功能［4］、降低血脂、抗血小板聚集［5］等多種生理活性，已被喻為繼紫杉醇后又一新的綠色抗癌藥物。白藜蘆醇主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松樹等21個科、31個屬的72種植物中，在湖南、貴州等地的刺葡萄中含量較高［6］。

刺葡萄(V.didii.Foex)是中國南方主要野生葡萄品種之一，湖南湘西一帶擁有廣泛的刺葡萄野生資源。刺葡萄具有粒小、皮厚、色深和產量高等特點，作為食用鮮果其市場受到一定限制［7］，但適宜用于葡萄酒的釀造［8］。由于中國葡萄酒生產季節(jié)性強、生產集中，釀酒后的酒渣往往來不及處理就被隨意拋棄或作為廢料處理，造成了極大的環(huán)境污染和資源浪費，因此，從刺葡萄酒渣中提取有價值的活性物質，變廢為寶，具有重要的經濟與環(huán)保效益。目前從刺葡萄酒渣中提取白藜蘆醇未見報道，本研究擬采用超聲輔助法從刺葡萄酒渣中提取白藜蘆醇，并對提取工藝進行優(yōu)化，以期為刺葡萄的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺葡萄酒渣:紫秋刺葡萄，湖南華淳莊園酒業(yè)有限公司;

反式白藜蘆醇苷標準品:純度＞98.6%，成都曼思特生物科技有限公司;無水乙醇:分析純，國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈:色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀:Agilent 1100 Series型，安捷倫科技有限公司;

電子分析天平:CP214型，奧豪斯儀器(上海)有限公司;

電熱恒溫鼓風干燥箱:DHG-9240A型，上海飛越實驗儀器有限公司;

中草藥粉碎機:FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司;

數(shù)控超聲波清洗器:KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料預處理 經電熱恒溫鼓風干燥箱50℃烘干，粉碎，過40目篩，4℃下避光儲藏，備用。

1.3.2 單因素試驗

(1)溶劑(乙醇)濃度對白藜蘆醇提取率的影響:準確稱取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，在料液比1∶15(m∶V)，超聲時間40 min，超聲溫度55℃的條件下，分別用20%，40%，60%，80%，99.7%的乙醇對刺葡萄酒渣中的白藜蘆醇進行提取，快速濾紙過濾，再經0.22 μm有機微孔濾膜后，用高效液相色譜測定白藜蘆醇含量。

(2)料液比對白藜蘆醇提取率的影響:準確稱取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(m∶V)分別加入一定體積80%的乙醇，在55℃下超聲提取40 min，快速濾紙過濾，再經0.22 μm有機微孔濾膜后，用高效液相色譜測定白藜蘆醇含量。

(3)超聲時間對白藜蘆醇提取率的影響:準確稱取6份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，用80%的乙醇在料液比1∶15(m∶V)，55℃條件下，分別超聲提取 10，20，30，40，50，60 min，快速濾紙過濾，再經0.22 μm有機微孔濾膜后，用高效液相色譜測定白藜蘆醇含量。

(4)超聲溫度對白藜蘆醇提取率的影響:準確稱取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分別放于不同的100 mL棕色容量瓶中，按料液比1∶15(m∶V)加入80%的乙醇，分別在25，40，55，70，85 ℃下超聲提取40 min，快速濾紙過濾，再經0.22 μm有機微孔濾膜后，用高效液相色譜測定白藜蘆醇含量。

1.3.3 響應面法優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken原理，以白藜蘆醇提取率為響應值，對料液比、超聲溫度、超聲時間進行三因素三水平的響應面試驗設計，運用Design-Expert 8.0.5.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析優(yōu)化，得出刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的最佳提取工藝。

1.3.4 白藜蘆醇提取率的測定

(1)色譜條件:參照GB/T 15038—2006，最終確定高效液相色譜測定條件為色譜柱:Agilent，ODS C18 hypersil(250 mm ×4.5 mm，5 μm);流動相:乙腈 +重蒸水 =30%+70%;柱溫:21℃;流速:1.0 mL/min;檢測波長:306 nm;進樣量:10 μL。

(2)標準曲線制作:精確稱取2.000 mg反式白藜蘆醇苷標準品于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得濃度為200 μg/mL的反式白藜蘆醇苷標準儲備液。分別準確吸取0.25，0.5，1，2，4 mL 于5 個不同的10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻得 5，10，20，40，80 μg/mL 的反式白藜蘆醇苷系列標準液。取10 μL在1.3.4(1)條件下進樣，以吸收峰面積值(Y)為縱坐標，反式白藜蘆醇苷濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，得標準曲線回歸方程:

式中:

Y——白藜蘆醇苷吸收峰面積;

X——白藜蘆醇苷濃度，μg/mL。

(3)樣品測定:吸取待測液 10 μL，在 1.3.4(1)條件下測定，重復2次。根據(jù)標準曲線得出待測液中白藜蘆醇苷的濃度，按式(2)計算提取率:

式中:

R——白藜蘆醇苷的提取率，μg/g;

C——待測液中白藜蘆醇苷的濃度，μg/mL;

V——提取溶劑的體積，mL;

M——樣品的質量，g。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對白藜蘆醇提取率的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，白藜蘆醇的提取率逐漸提高，當提取劑乙醇濃度為80%時，提取率達到最大值，繼續(xù)增加乙醇濃度，白藜蘆醇提取率反而略有下降。這可能是因為白藜蘆醇含有多個酚羥基，具有較大的極性，根據(jù)相似相溶原理，當溶劑極性與白藜蘆醇極性相當時，白藜蘆醇溶解性大，提取率高。但乙醇濃度過高時，大量脂溶性色素溶出，與白藜蘆醇競爭溶劑分子，從而導致白藜蘆醇提取率略有下降。故選取80%乙醇為提取劑。

圖1 乙醇濃度對白藜蘆醇提取率的影響Figure 1 Effects of ethanol concentration on the extraction of resveratrol

2.1.2 料液比對白藜蘆醇提取率的影響 由圖2可知，在料液比為1∶10～1∶20(m∶V)時，白藜蘆醇的提取率隨著溶劑體積的增加而增大，但當料液比小于1∶20(m∶V)后，隨著溶劑體積的增大，白藜蘆醇的提取率反而降低。這是由于在提取過程中，刺葡萄酒渣粉末的質量固定，當溶劑體積較小時，隨著溶劑的增加，有效成分與溶劑的接觸面積增大，從而使白藜蘆醇的提取率升高;但當溶劑體積過大時，超聲波輻射被溶劑大量吸收，穿透能力下降，作用于物料的有效輻射降低，從而影響有效成分的提?。?］，同時溶劑體積過大會造成溶劑浪費。故選取最佳料液比為1∶20(m∶V)。

2.1.3 超聲時間對白藜蘆醇提取率的影響 由圖3可知，隨著超聲時間的延長，白藜蘆醇的提取率上升，且在40 min內，增幅明顯。但提取時間超過40 min后，白藜蘆醇的提取率趨于平穩(wěn)，甚至略有下降，這可能是由于超聲時間過長，空化效應的作用力降低，也有可能是長時間的超聲破壞了白藜蘆醇的結構，導致白藜蘆醇部分降解。故選取最佳提取時間為40 min。

圖2 料液比對白藜蘆醇提取率的影響Figure 2 Effects of solid/solvent ratio on the extraction of resveratrol

圖3 超聲時間對白藜蘆醇提取率的影響Figure 3 Effects of ultrasonic time on the extraction of resveratrol

2.1.4 超聲溫度對白藜蘆醇提取率的影響 由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，白藜蘆醇的提取率逐漸提高，這是因為超聲溫度升高能使植物組織軟化，提高有效成分的擴散速度;當溫度為55℃左右時，提取率達到最大值，繼續(xù)提高超聲溫度，白藜蘆醇的提取率略有下降。且高溫會破壞白藜蘆醇的生理活性，故選取最佳超聲溫度為55℃。

圖4 超聲溫度對白藜蘆醇提取率的影響Figure 4 Effects of ultrasonic temperature on the extraction of resveratrol

2.2 響應面法優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面分析試驗結果 綜合單因素試驗結果，選取料液比、超聲溫度、超聲時間為響應面優(yōu)化的三因素，對白藜蘆醇的提取率進行分析，具體試驗方案及結果見表1、2。

表1 響應面分析試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM test

表2 響應面分析試驗設計方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

運用Design-Expert 8.0.5.0軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的提取率與所選3個因素的二元多次回歸方程為:

對表2試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型的F=86.81，P＜0.000 1，表示模型顯著，且模型的失擬項P=0.175 8＞0.05，不顯著，表明模型擬合度較好，殘差均由隨機誤差引起。模型的決定系數(shù)R2=0.991 1，表明響應值白藜蘆醇提取率實際值與預測值之間具有良好的擬合度，調整系數(shù)Radj2=0.979 7，說明該模型能用于解釋97.97%響應值的變化，預測系數(shù)Rpred2=0.899 7，說明該模型預測性良好［10，11］，所以，該模型可用于刺葡萄酒渣中白藜蘆醇提取條件的分析和預測。且各因素的一次項和二次項的影響均為極顯著(P≤0.01)，說明各因素對刺葡萄酒渣中白藜蘆醇提取率的影響并非簡單的線性關系［12］。根據(jù)各因素F值的大小可得，影響白藜蘆醇提取率的因素主次順序為:超聲時間＞超聲溫度＞料液比。

表3 響應面結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results

表3 響應面結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results

＊＊表示影響極顯著，P≤0.01;*表示影響顯著，P≤0.05;N表示影響不顯著，P＞0.05。

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P 值 顯著性模型 3 448.84 9 383.20 86.81 ＜0.000 1＊＊A 319.79 1 319.79 72.45 ＜0.000 1 ＊＊ 3 479.74 16 B 30.90 7 4.41失擬項 20.83 3 6.94 2.76 0.175 8 N純誤差 10.07 4 2.52總和565.82 1 565.82 128.19 ＜0.000 1 ＊＊C 1 159.21 1 1 159.21 262.61 ＜0.000 1 ＊＊AB 0.71 1 0.17 0.038 0.850 8 N AC 27.04 1 27.04 6.13 0.042 5 *BC 5.71 1 5.71 1.29 0.292 7 N A2 444.01 1 444.01 100.59 ＜0.000 1 ＊＊B2 525.72 1 525.72 119.10 ＜0.000 1 ＊＊C2 260.72 1 260.72 59.07 0.000 1 ＊＊殘差

2.2.2 響應面交互作用分析 根據(jù)回歸方程，將其中任一因素固定在0水平?？梢缘玫襟w現(xiàn)另外兩因素及其交互作用的響應曲面圖［13］(見圖5～7)。由圖5～7可知，沿時間軸向等高線變化最密集，且時間曲線最陡峭，說明超聲時間對響應值的影響最顯著［14］，這與表3中根據(jù)各因素的F值大小得出的結論符合;分析等高線，結合表3中各因素的P值可知，超聲時間和料液比的交互作用顯著。

圖5為超聲時間為40 min時，溫度和料液比及其交互作用對白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖5可知，當料液比一定時，隨著溫度的升高，白藜蘆醇的提取率呈先增高后降低的趨勢;當溫度一定時，白藜蘆醇的提取率隨著溶劑體積的增大而先增大后平緩。

圖5 超聲溫度和料液比對白藜蘆醇提取率影響的響應面Figure 5 Responsive surface and contours of the effect of temperature and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol

圖6為超聲溫度為55℃時，超聲時間和料液比及其交互作用對白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖6可知，當料液比一定時，隨著超聲時間的延長，白藜蘆醇的提取率增大;當超聲時間一定時，隨著溶劑體積的增大，白藜蘆醇提取率先增大再減少，且增大的幅度并不大。

圖7為料液比為1∶15(m∶V)時，超聲時間和溫度及其交互作用對白藜蘆醇提取率影響的曲面圖。由圖7可知，當超聲時間一定時，隨著溫度的升高，白藜蘆醇的提取先增大后略有減少;當超聲溫度一定時，白藜蘆醇的提取率隨超聲時間的增加而增加。

2.2.3 白藜蘆醇最優(yōu)工藝條件的確定與驗證 在各因素選定范圍內，利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對模型進行分析優(yōu)化，預測出最優(yōu)提取條件為超聲溫度61.37℃，超聲時間48.67 min，料液比 1∶17.11(m∶V)，且在該條件下白藜蘆醇提取率的預測值為191.63 μg/g?？紤]到實際操作的方便，將提取工藝參數(shù)調整為:超聲溫度61℃，超聲時間49 min，料液比1∶17(m∶V)，并在該條件下進行3次平行驗證實驗，白藜蘆醇(以反式白藜蘆醇苷的形式存在)的平均提取率為 191.53 μg/g，與理論預測值 191.63 μg/g 接近，表明響應面優(yōu)化試驗得到的提取工藝參數(shù)可靠。

圖6 超聲時間和料液比對白藜蘆醇提取率影響的響應面Figure 6 Responsive surface and contours of the effect of time and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol

圖7 超聲時間和溫度對白藜蘆醇提取率影響的響應面Figure 7 Responsive surface and contours of the effect of time and temperature on the extraction rate of resveratrol

3 結論

本研究在單因素試驗基礎上，利用響應面法對刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，并建立了白藜蘆醇提取率與超聲溫度、超聲時間、料液比3個因素的二次多項式回歸模型，通過驗證實驗證明該模型是科學可靠的。

本研究經優(yōu)化得出超聲輔助提取刺葡萄酒渣中白藜蘆醇的最優(yōu)工藝為:超聲溫度61℃，超聲時間49 min，料液比1∶17(m∶V)，此條件下白藜蘆醇(以反式白藜蘆醇苷的形式存在)的提取率為191.53 μg/g，與預測值相近，且高于任何一次單因素試驗，證明優(yōu)化得到的提取工藝準確可靠。

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