病毒性腦炎的病原學(xué)檢測與分析

李東瑞 丁雪冰 王雪晶 滕軍放

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

腦炎是感染性疾病中較嚴(yán)重的一種，病毒是急性腦炎中最常見的感染源。病毒性腦炎是指病毒直接侵犯腦實質(zhì)而引起的原發(fā)性腦炎，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、頭痛、意識障礙、癲癇、精神行為異常及神經(jīng)系統(tǒng)定位體征。

1 流行病學(xué)

流行病學(xué)報告腦炎的發(fā)病率有很大的地理差異性，在正常情況下，年發(fā)病率3．5／100 000～7．5／100 000。雖然病毒性腦炎可影響各個年齡段，但在兒童期更加明顯［1-4］。

2 病原學(xué)分類

許多患者被診斷為腦炎，卻沒有檢測到特定的病原體。隨著分子生物學(xué)技術(shù)，特別是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用及進(jìn)步，特發(fā)性的病例相對比例可能會下降，但不到半數(shù)的患者能檢測出病原體，可能與未知的免疫相關(guān)性腦炎有關(guān)［5］。在全球范圍內(nèi)及特殊地區(qū)發(fā)現(xiàn)的幾十種病毒和細(xì)菌可能引起腦炎［1］。見表1。

3 病原學(xué)檢測方法分析

不同類型VE的診斷技術(shù)類同，但目前普遍缺少病原學(xué)與基因組學(xué)的診斷方法。近年來病原學(xué)診斷方法的研究有很大進(jìn)展。

3．1 病毒分離 目前被認(rèn)為是病毒性腦炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，特點是診斷特異性好，操作復(fù)雜，且成功率低，花費較高，臨床上較難普及。

3．2 病毒特異性抗體檢測 有數(shù)種病毒可在血清和腦脊液中通過酶免疫測定，如單純皰疹病毒1 型與2 型（HSV-1／HSV2）、水痘病毒（VZV）、EB病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、人類免疫缺陷病毒（HIV）、腺病毒、流感病毒等［6］。蛋白質(zhì)印記法（Western blot）用于識別腦脊液及血清中的特異性抗體，在病毒感染性疾病中被作為確診實驗，但由于其敏感性較ELISA 低，因此未成為首選診斷技術(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢出率低，存在假陰性，并在許多檢測中都有相關(guān)報道［7-8］，主要有以下幾種原因：（1）試劑本事的質(zhì)量問題；（2）操作過程中出現(xiàn)的問題；（3）鉤狀效應(yīng)，即抗原-抗體需要在最適比濃度下進(jìn)行，如有大量抗體存在同時其濃度大大超過抗原，可導(dǎo)致陰性結(jié)果。但隨著ELISA 方法的改良及進(jìn)步，其敏感性逐漸升高，可用于大規(guī)模血清學(xué)監(jiān)測。

表1 病原學(xué)

3．3 病毒抗原檢測 雖然在血清中HSV、VZV、RSV、流感病毒A、B以及腺病毒可通過傳統(tǒng)的免疫熒光法對其咽拭子標(biāo)本進(jìn)行抗原檢測，但由于腦脊液中抗原含量較低，檢出率較低，不能用于腦脊液病毒抗原檢測。

新型ELISA 方法基于雙抗體夾心模式，同樣可應(yīng)用病毒抗原檢測。2001年BODE等曾用該方法檢測博爾納病病毒（Borna disease virus，BDV）的磷蛋白（p24）和核蛋白（p40）構(gòu)象。該方法兼顧有較高的特異性及敏感性，同時有EILSA法的穩(wěn)定性好、操作方便等優(yōu)點。

3．4 聯(lián)合檢測 Bode等［9］研究也同時提出了BDV-CIC、有利抗體和血漿抗原檢測相同樣本的差異性，該方法檢測感染陽性率比單純血清學(xué)檢測敏感10倍以上，但仍需進(jìn)一步研究是否用于大規(guī)模檢測。

3．5 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） CSF-PCR 是將CSF 中微量的病毒基因迅速擴(kuò)增百萬倍，常規(guī)RT-PCR分反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增兩步驟，該方法是在同一體系下，同時進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR，可在短時間內(nèi)完成，是早期快速診斷的常用方法。但由于PCR 技術(shù)敏感性較高，因此，在實驗操作中必須采取嚴(yán)格無菌措施防止污染，以提高診斷的特異性。

隨著PCR 技術(shù)的進(jìn)步和擴(kuò)展，目前已從最初的RT-PCR發(fā)展到與各項技術(shù)集合起來的新技術(shù)，如實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR）、多重RT-PCR等。

實時熒光定量PCR 起源于1999年Scorpions引物的發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)改進(jìn)誕生的二聚體Scorpion［10］、特異引物、PCR 終止物和熒光基團(tuán)組成的一條寡核苷酸，淬滅劑結(jié)合在與探針完全互補(bǔ)的另一條寡核苷酸的3＇末端。熒光實時PCR 定量具有范圍寬、敏感性高、精度高、無PCR 后處理步驟，避免了交叉污染，同時可進(jìn)行多重檢測等優(yōu)點。

病毒性腦炎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的感染性疾病，嚴(yán)重的顱內(nèi)病毒感染可能會導(dǎo)致死亡，患者往往遺留永久性的神經(jīng)后遺癥［11-14］。目前，支持對癥治療超過抗病毒治療［15-16］。因此，病毒性腦炎的病原學(xué)檢測尤為重要。通過對樣本的抗原、抗體及免疫復(fù)合物檢測以及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用，為病毒性腦炎的診斷提供病原學(xué)依據(jù)，幫助診斷和治療病毒性腦炎患者。

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