抑癌基因DPC4／smad4、P16在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

宋文慶 俞 嵐 陶儀聲 吳 強(qiáng)

（1安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥230032；2蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽233030）

食管癌是食管粘膜上皮發(fā)生的惡性腫瘤，死亡率較高，位居腫瘤死亡的第4位。在食管癌的發(fā)生過程中，涉及多種抑癌基因的改變。1996年，由Hanh SA［1］等首先發(fā)現(xiàn)的抑癌基因 DPC4，經(jīng)研究證實(shí)，其失活與肺癌［2］、結(jié)腸癌［3］、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌［4］等的發(fā)生具有密切的關(guān)系。DPC4的產(chǎn)物Smad4是轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β（TGF－β）信號(hào)傳導(dǎo)中的中心“角色”，DPC4是TGF－β受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)路中的一種轉(zhuǎn)錄因子，其基因缺失、突變將導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖與生長(zhǎng)。p16基因是第一個(gè)被證明參與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的抑癌基因，其編碼生成的P16蛋白是細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)物［5］。通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin －dependent kinase，CDK）活性，參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生［6］。目前的研究證實(shí)，在肺癌［7］、乳腺癌［8］、鼻咽癌［9等惡性腫瘤中均有P16基因的表達(dá)缺失。食管鱗狀細(xì)胞癌中，關(guān)于抑癌基因P16與DPC4的表達(dá)情況，尤其是P1與DPC4的關(guān)系，以及二者的失活與患者生存預(yù)后的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)80例食管鱗狀細(xì)胞癌及30例癌旁組織中DPC4／smad4和P16的表達(dá)情況，探討二者的相關(guān)性及其與患者生存預(yù)后的關(guān)系。

材料和方法

1.標(biāo)本來源

收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2007年1月～2008年6月存檔石蠟包埋食管癌病例組織標(biāo)本80例（所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌，且術(shù)前均未行放、化療）和癌旁食管粘膜組織標(biāo)本30例，所有病例均有完整的臨床及病理資料，其中男性63例，女性17例。年齡37～76（60.06±8.57）歲，＜60歲37例，≥60歲43例。入選病例隨訪至患者死亡或截止2011年2月。隨訪時(shí)間為5－56個(gè)月。按分化程度分為：高分化24例，中分化36例，低分化20例。按淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移，有轉(zhuǎn)移38例，沒有轉(zhuǎn)移42例。腫瘤的最大平均直徑3.0cm。根據(jù)UICC2002版PTNM病理分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中Ⅰ期－Ⅱ期患者40例，Ⅲ期－Ⅳ期患者40例。對(duì)照組為正常食管黏膜30例，取自腫塊＞5.0cm處，病理HE染色證實(shí)為正常食管黏膜。

2.試劑

鼠抗人P16單克隆抗體（克隆號(hào)：MX007）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；鼠抗人DPC4單克隆抗體（克隆號(hào)：IMD－89）由北京中杉公司代理，購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公 司，為 濃縮型；ElivisionTM plus試劑盒以及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)ElivisionTM plus法，將石蠟標(biāo)本以4μm厚連續(xù)切片、烤干，于二甲苯溶液及不同濃度的乙醇中脫蠟至水洗。免疫組化染色操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。采用已知陽性片作對(duì)照，以PBS液代替一抗作空白對(duì)照。同時(shí)，為確定一抗抗原的免疫反應(yīng)特異性，進(jìn)行抗體吸收實(shí)驗(yàn)作為陰性對(duì)照。

4.結(jié)果判斷

DPC4以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。P16基因以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采取二次計(jì)分法：每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞所占百分比并計(jì)分。首先按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞為＜10%，2分為11% ～50%，3分為51% ～75%，4分為＞75%。用染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積作為判斷表達(dá)結(jié)果，若積分≤1為陰性，＞1為陽性。免疫組化結(jié)果由兩位高年資病理醫(yī)生采用獨(dú)立雙盲法判定。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

DPC4／smad4和P16表達(dá)陽性組與陰性組生存分析用 Kaplan－Meier法，組間比較用log－rank檢驗(yàn)，多因素分析采用Cox回歸多因素模型，DPC4／smad4和P16在食管癌組織、正常食管黏膜組織中的表達(dá)及其與各臨床及病理因素的相關(guān)性采用Fisher exact法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.食管鱗狀細(xì)胞癌中DPC4／Smad4的表達(dá)及其與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

DPC4／smad4蛋白主要定位于食管鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞的胞膜和胞漿，為黃色或棕黃色顆粒（圖1）。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，DPC4／smad4陽性率為43.8%（35／80），對(duì)照組正常食管粘膜組織中為 80.0%（24／30）（P＜0.01）。DPC4／smad4的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫塊大小等因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）；隨著DPC4／smad4的表達(dá)程度的降低，癌組織的分化越差、臨床分期越晚、更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.01，表1）。

2.食管鱗狀細(xì)胞癌中P16的表達(dá)及其與各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

P16蛋白主要定位于食管鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞的胞核，為黃色或棕黃色顆粒（圖2）。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，P16的陽性率為31.1%（35／80），較正常食管粘膜的表達(dá)率93.0%（28／30）明顯減少（P＜0.01，圖2B）。P16的表達(dá)與患者的性別、年齡、腫塊大小等因素均無關(guān)（P＞0.05），而與食管鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分化程度、臨床分期及轉(zhuǎn)移與否有關(guān)，P16的表達(dá)程度的降低，腫瘤組織的分化越差、臨床分期越晚、更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移（表1）。

3.食管鱗狀細(xì)胞癌中DPC4／smad4與P16的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織DPC4／smad4與P16的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.898，P＜0.01，表2）。

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌中DPC4／Smad4、P16與臨床病理因素的關(guān)系Table 1 Correlation of the expressions of DPC4／Smad4，P16with clinicopathological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌中DPC4／Smad4、P16的表達(dá)之間的相互關(guān)系Table 2 Expression of DPC4／Smad4、P16，and their relationship in esophageal squamous cell carcinoma

表3 80例食管鱗狀細(xì)胞癌患者多因素分析Table 3 Multivariate survival analysis of 80patients with Esophageal Cancer

4.生存分析

本組病例總的5年生存率為37.5%。Kaplan－Meier生存分析顯示P16陽性組與陰性組5年生存率分別為65.7%和13.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）；DPC4陽性組與陰性組5年生存率分別為68.6%和13.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。生存曲線見圖3、圖4。

5.多因素分析

將病例年齡（分為≤60歲組與＞60歲組）、性別（男性組與女性組）、腫瘤直徑（分為≤3.0cm組與＞3.0cm組）、分化程度（分為高分化組、中分化組與低分化組），PTNM分期（分為Ⅰ、Ⅱ期組與Ⅲ 、Ⅳ期組）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（分為有轉(zhuǎn)移組與無轉(zhuǎn)移組）、DPC4（分為表達(dá)陽性組與陰性組）和P16（分為表達(dá)陽性組與陰性組）等因素引入Cox模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示：DPC4和P16的表達(dá)及PTNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管鱗狀細(xì)胞癌根治術(shù)后患者 預(yù)后的獨(dú)立因素（見表4）。

圖1 DPC4／Smad4在食管鱗狀細(xì)胞癌及正常食管粘膜中的表達(dá)（ElivisionTM×400）Fig.1Positive staining of DPC4／Smad4in esophageal squamous cell carcinoma （A）and normal esophageal mucosa （B）（ElivisionTM×400）

圖2 P16在食管鱗狀細(xì)胞癌及正常食管粘膜中的表達(dá)（ElivisionTM×400）Fig.2Negative staining of P16in esophageal squamous cell carcinoma（A）and normal esophageal mucosa（B）（ElivisionTM×400）

圖3 DPC4／Smad4表達(dá)陽性組與陰性組食管；鱗狀細(xì)胞癌生存曲線Fig.3Survival curves of squamous cell carcinoma patient with positive or negative DPC4or expression.

圖4 P16表達(dá)陽性組與陰性組食管；鱗狀細(xì)胞癌患者生存曲線Fig.4Survival curves of squamous cell carcinoma patients with positive negative P16expression

討 論

DPC4基因的蛋白產(chǎn)物Smad4是TGF－β超家族受體的直接底物。而TGF－β是細(xì)胞有絲分裂的抑制物，所以凡是參與TGF－β信號(hào)傳導(dǎo)過程中的元件均被認(rèn)為是腫瘤抑制物。DPC4基因在TGF－β信號(hào)通路中通過其蛋白產(chǎn)物Smad4與不同的Smad蛋白相互作用，編碼一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信使，成為TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心環(huán)節(jié)。DPC4基因的失活將導(dǎo)致Smad－TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的破壞，解除TGF－β信號(hào)途徑的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，失去對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用［3，4］，細(xì)胞過度生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在食管癌組織中DPC4的陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于癌旁組織（P＜0.05），而且分化程度越差，臨床分期越晚其陽性率越低。同時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中DPC4陽性率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］。這一結(jié)果提示我們，DPC4基因的失活可能是導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生原因之一。

抑癌基因P1 6的表達(dá)產(chǎn)物（MTSI）是細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK4）的抑制蛋白，而CDK 4是使細(xì)胞增殖周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵因子，是真核細(xì)胞增殖分裂的中心。P16蛋白通過與細(xì)胞周期素D競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合細(xì)胞周期素依賴性激酶（CDK4），導(dǎo)致CDK4的失活，抑制了細(xì)胞的過度分裂，成為細(xì)胞增殖過程中的負(fù)調(diào)控因子。當(dāng)P16基因發(fā)生突變或缺失時(shí)，會(huì)產(chǎn)生無活性 的P16蛋白或P16蛋白產(chǎn)物缺乏，對(duì)CDK4的抑制解除，細(xì)胞因此獲得無限增殖能力，出現(xiàn)無節(jié)制的分裂增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，80例食管鱗狀細(xì)胞癌中，P16的陽性率為31.1%，較正常食管粘膜的表達(dá)率93.0%明顯減少（P＜0.01）。隨著P16表達(dá)程度的降低，腫瘤組織的分化越差、臨床分期越晚、更易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11］。

既然P16和DPC4都是通過對(duì)周期蛋白依賴激酶（CDK）的抑制作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控的，我們推測(cè)二者之間可能存在某種內(nèi)在的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)對(duì)P16和DPC4在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，DPC4與P16的表達(dá)呈正相關(guān)性（r＝0.898，P＜0.01）。但是對(duì)于二者的因果關(guān)系，尚有不同看法。Hannon［12］等發(fā)現(xiàn) TGF－β可以刺激p16家族中的另一成員P15的表達(dá)，從而控制細(xì)胞增生。在對(duì)大腸癌研究中也發(fā)現(xiàn)TGF－β與P 16表達(dá)呈正相關(guān)。我們據(jù)此推測(cè)，DPC4作為TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要基因，其失活以后，Smad－TGF－β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻，使得P16表達(dá)下降，因此對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用消除，細(xì)胞大量增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。但是 MikiYamano［13］等研究顯示，在胰腺癌中無P16基因改變的標(biāo)本，P53、DPC4基因不發(fā)生改變，因此認(rèn)為P16基因的改變是P53基因和DPC4基因失活的必要階段。按照這一結(jié)果，雖然DPC4與P16的表達(dá)存在相關(guān)性，但是P16基因的失活不是DPC4基因失活的結(jié)果，而是導(dǎo)致DPC4失活的原因。郭樹彬等［14］應(yīng)用基因芯片對(duì)16例胰腺癌組織的研究顯示，7例出現(xiàn)DPC4基因改變的標(biāo)本，也同時(shí)出現(xiàn)p16基因改變，。簡(jiǎn)而言之，P16基因失活以后導(dǎo)致了DPC4基因的失活，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用解除，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)提示，P16和DPC4在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)確實(shí)存在正相關(guān)性，這說明DPC4基因和P16基因在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生中有著協(xié)同作用，與花瞻等［15］在胰腺癌中的研究結(jié)果一致。但二者表達(dá)的內(nèi)在因果關(guān)系以及對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控的協(xié)同作用機(jī)制，尚不清楚，需進(jìn)一步的研究探討。。

本研究多因素分析顯示，P16和DPC4的表達(dá)、PTNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。P16及DPC4陽性組患者5年生存率分別為65.7%和68.6%，均明顯高于陰性組患者13.0%和13.3%（均為P＜0.05）。這一結(jié)果提示，P16與DPC4的表達(dá)對(duì)于食管癌患者的生存率及生存期的估計(jì)可能有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，P16與DPC4基因的失活是導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的重要原因。同時(shí)，由于P16與DPC4基因均是通過對(duì)細(xì)胞周期依賴激酶的抑制來調(diào)控細(xì)胞周期的，二者有明顯的相關(guān)性。二者的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的組織分化、臨床分期、生存率均有相關(guān)性。因此，在食管鱗狀細(xì)胞癌中檢測(cè)P16和DPC4的表達(dá)情況可以幫助臨床分期評(píng)估預(yù)后。

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