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    Hes1在高溫致神經(jīng)管畸形上皮細(xì)胞中的表達(dá)變化

    2014-12-19 07:10:48劉文靜張?zhí)炝?/span>李鋒杰洪2
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)管胚胎干細(xì)胞

    閆 雪 劉文靜 張?zhí)炝?趙 會(huì) 李鋒杰 于 麗 江 洪2

    (濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;1濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院,山東261053;2濰坊市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 山東261041)

    神經(jīng)管畸形(neural tube defect,NTD)是人類在胚胎早期發(fā)育過程中由于神經(jīng)管閉合不全而引起的一類先天缺陷,也是胚胎和圍產(chǎn)兒致殘的主要原因,包括無腦、露腦、脊柱裂、腦積水等多種臨床表型。NTD是人類出生缺陷中較為常見的一種出生缺陷,影響1‰的胎兒存活率[1]。目前引起孕產(chǎn)婦NTD的原因有很多,尤其是高熱、糖尿病、高胰島素血癥、肥胖、各種社會(huì)生理和心理因素[2]。其中高溫是最為常見的物理致畸因素之一。人類約10%的神經(jīng)管畸形為孕早期高熱所致,但高溫誘發(fā)NTD確切的分子機(jī)制仍不清楚[3]。轉(zhuǎn)錄抑制因子(Hairy and enhancer of split homolog-1,Hes1)屬于bHLH堿性-螺 旋-環(huán)-螺旋 (basic-h(huán)elix-loop-h(huán)elix)轉(zhuǎn) 錄 因子超家族HES/HEY成員之一,是Notch信號(hào)通路的下游靶基因,下傳Notch信號(hào),可使多種不成熟細(xì)胞維持在未分化狀態(tài),調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)分化誘導(dǎo)因子的反應(yīng),維持未分化細(xì)胞數(shù)量上的穩(wěn)定,使干細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)在高溫致NTD模型上,通過Western blot技術(shù)和免疫熒光染色技術(shù)觀察Hes1在胎鼠神經(jīng)上皮細(xì)胞的表達(dá)變化,探討Hes1與神經(jīng)管發(fā)育和高溫致畸發(fā)生之間的關(guān)系,為防治NTD的發(fā)生提供理論依據(jù)。

    材料和方法

    1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本制備

    成年未經(jīng)產(chǎn)雌性金黃地鼠50只,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,體重100±10g,鼠顆粒飼料喂養(yǎng),常規(guī)飲水。于晚7-9時(shí)與雄鼠1∶1合籠,次日查有精子者定為孕第1d(E1)。將孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組于E8下午3-4時(shí),置42℃水浴,持續(xù)20min,水浴后16h、24h、36h、48h(相當(dāng)于E8.5、E9、E9.5、E10)將孕鼠處死,剖腹取鼠胚,制備高溫致NTD動(dòng)物模型;對(duì)照組置37℃水浴,持續(xù)20min,在相同的時(shí)間點(diǎn)取材。分別用4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片,厚5μm,裱片后備染。

    2.Western blot技術(shù)

    解剖顯微鏡下分離神經(jīng)管組織,將神經(jīng)管組織置于冰上,4℃12000r/min離心15min,提取上清,用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將20μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PADE電泳,恒壓90V將蛋白轉(zhuǎn)自PVDF膜(Millipore),轉(zhuǎn)膜時(shí)間1h。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉抗原2h后放入TBST稀釋一抗兔抗 Hes1(1∶1000,Abcam)中4℃冰箱孵育過夜,用TBST稀釋羊抗兔IgG(1∶2500,Cell Signaling )室溫?fù)u床2h,ECL 發(fā)光液(Thermo)反應(yīng)15min,在暗室中進(jìn)行曝光顯影定影。β-actin(1∶500,北京中杉金橋生物技術(shù)公司)作為對(duì)照,內(nèi)參檢測(cè)方法相同。利用凝膠成像儀灰度分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

    3.免疫熒光染色

    切片常規(guī)脫蠟入水,0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波抗原修復(fù),冷卻后用 PBS沖洗;滴加正常山羊血清,37℃孵育30min,分別滴加兔抗Hes1(1∶200,Abcam),4 ℃冰箱過夜;分別滴加TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶100,北京中杉金橋生物技術(shù)公司),避光條件下37℃孵育50min;滴加 Hoechst(1∶800,Molecular Probes),37℃避光孵育30min,PBS沖洗;以防淬滅封片劑封片,4℃冰箱避光保存;熒光顯微鏡觀察、拍照。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,以檢查免疫熒光反應(yīng)的特異性。

    4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    每組取免疫熒光切片10張,經(jīng)正置熒光顯微鏡(LEICADM1000)觀察拍片,將所得圖片在IPP6.0圖像分析軟件中進(jìn)行圖像分析,經(jīng)剪除背景,屏分割和選擇刪除后,測(cè)量各組陽性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度(OD值)。每組取5張Western blot顯影膠片置于掃描儀掃描,用Quntity one圖像分析軟件測(cè)定Western blot顯示條帶的光密度值,進(jìn)行目的條帶與內(nèi)參條帶光密度比值計(jì)算、分析。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析,將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相應(yīng)部位的OD值(平均光密度±標(biāo)準(zhǔn)差)作t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01差異具有顯著性。

    結(jié) 果

    1.Western blot檢測(cè)結(jié)果

    E8.5-E10,對(duì)照組金黃地鼠胚胎神經(jīng)管組織中Hes1穩(wěn)定表達(dá),且無明顯量的變化(P>0.05)。與對(duì)照組相比,高溫組各時(shí)間點(diǎn)(E8.5,E9,E9.5,E10)Hes1蛋白的表達(dá)呈不同程度的降低,尤其是E8.5和E9.5差異明顯(*P<0.05)(圖1)。

    圖1 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和NTD組金黃地鼠神經(jīng)管組織中Hes1蛋白水平。A.E8.5-E10,對(duì)照組和NTD組金黃地鼠Hes1蛋白水平;B.E8.5-E10,對(duì)照組和NTD金黃地鼠Hes1蛋白水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(*P<0.05)Fig.1Hes1protein level of neural tube tissue in the control and NTD golden hamster at different points.A.E8.5-E10,Western blot detection of Hes1protein level in the control and NTD golden hamster at different points.B.E8.5-E10,Statistical analysis of Hes1protein level in the control and NTD golden hamster at different points(*P<0.05).

    2.Hes1免疫熒光染色結(jié)果

    E8.5-E10,Hes1在鼠胚神經(jīng)管上皮細(xì)胞和周圍間充質(zhì)細(xì)胞的胞漿廣泛表達(dá);E9.5、E10,Hes1陽性表達(dá)主要分布于腹側(cè)和腹外側(cè)上皮細(xì)胞中。E8.5-E10,高溫組胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞內(nèi)的Hes1表達(dá)量較對(duì)照組均有不同程度的減弱,其中E8.5、E9.5差異顯著(P<0.05)(圖2)。

    圖2 免疫熒光染色示各時(shí)間點(diǎn)Hes1在胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞中的表達(dá)。A:Hes1免疫熒光染色結(jié)果:a-d.分別代表對(duì)照組E8.5,E9,E9.5,E10;e-h(huán)分別代表高溫組E8.5,E9,E9.5,E10。bar=50μm。B:OD值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(*P<0.05)。紅色代表Hes1,藍(lán)色代表Hoechst。Fig.2Hes1immunofluorescent staining of embryonic neuroepithelial cells in different time.A:Hes1immunofluorescent staining results:a-d.control groups E8.5-E10;e-h(huán).NTD groups E8.5-E10.bar=50μm.B:The statistical result of OD.(*P<0.05).Red represents Hes1,blue represent Hoechst.

    討 論

    胚胎發(fā)育是一個(gè)受基因嚴(yán)密調(diào)控的過程,致畸原可通過直接或間接作用干擾已知或未知發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá),如發(fā)育基因、受體基因、生理因子基因以及原癌基因等[4]。NTD是一組受多因素影響,涉及多個(gè)基因的復(fù)雜畸形,是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[5]。其中高溫因素包括孕產(chǎn)婦流感、普通感冒、發(fā)熱和高熱等。在小鼠中大約有200個(gè)基因突變可以導(dǎo)致NTD,在人類則表現(xiàn)為一個(gè)多因子的多基因或寡基因的病因?qū)W發(fā)生模式,說明NTD中基因-基因之間,基因-環(huán)境之間相互作用的重要性[6]。研究發(fā)現(xiàn),高溫可使與細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)的蛋白特別是酶蛋白和信息蛋白表達(dá)異常,從而干擾細(xì)胞分化;高溫可使細(xì)胞周期阻滯,細(xì)胞分裂減少,細(xì)胞凋亡增加[7]。

    Hes基因家族包括 Hes1-7,其中 Hes1是Notch信號(hào)通路的下游基因,大量表達(dá)于哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中上皮細(xì)胞及神經(jīng)干細(xì)胞[8]。在人類,此基因定位于3q28-q29,轉(zhuǎn)錄的mRNA由1471個(gè)堿基對(duì)組成,共包含有4個(gè)外顯子,其編碼的Hes1蛋白是由280個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量為29400。研究顯示胚胎腦組織中的神經(jīng)前體細(xì)胞保持未分化狀態(tài)需要Hes1的適當(dāng)表達(dá),但Hes1的持續(xù)高表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的分裂和增殖,因此Hes1在控制神經(jīng)前體細(xì)胞的數(shù)量以及神經(jīng)細(xì)胞的分化和增殖中具有十分重要的作用[9]?;虬邢蜃饔醚芯匡@示,Hesl基因敲除的小鼠Mashl表達(dá)量上調(diào),新生神經(jīng)細(xì)胞過早成熟,最終出現(xiàn)神經(jīng)管發(fā)育缺陷甚至是胚胎的死亡[10]。

    實(shí)驗(yàn)顯示神經(jīng)管發(fā)育過程中Hes1蛋白穩(wěn)定表達(dá);但高溫后,NTD組Hes1表達(dá)降低,說明高溫抑制了Hes1的表達(dá)。Taeko等[11]研究顯示Hes1對(duì)維持神經(jīng)干細(xì)胞狀態(tài)發(fā)揮重要作用,缺乏Hes1神經(jīng)干細(xì)胞將會(huì)過早分化。Hes1可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向中胚層分化,但在胚胎干細(xì)胞中胚層早期階段分化停止,說明Hes1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞中胚層分化,進(jìn)一步說明Hes1抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化。郇林春[12]等研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中,Hes1蛋白功能的缺失可能會(huì)造成胚胎的無腦畸形,其過高表達(dá)可能會(huì)抑制神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和分化,使神經(jīng)祖細(xì)胞保持在未分化狀態(tài)。在神經(jīng)干細(xì)胞中,Notch信號(hào)通路在維持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化過程中起關(guān)鍵作用,Notch誘導(dǎo)Hes1/5的表達(dá),抑制原始基因表達(dá)從而抑制神經(jīng)細(xì)胞的分化[13-14]。以上均說明Hes1抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化,從而維持神經(jīng)干細(xì)胞的原始狀態(tài)。可見,高溫致NTD過程中,高溫抑制Hes1的表達(dá),從而影響了神經(jīng)管的正常發(fā)育。由此說明Hes1表達(dá)降低在高溫致NTD的過程中發(fā)揮了重要作用,這為進(jìn)一步闡明高溫致NTD的機(jī)制提供了理論依據(jù)。

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