附子水提物對大鼠十二指腸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白表達(dá)的影響

季苗苗 梁新麗 鐘友寶 陳來 廖正根

中圖分類號 R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2813-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.15

摘 要 目的：研究附子水提物對大鼠十二指腸組織中3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和3種緊密連接蛋白及其基因表達(dá)的影響。方法：取32只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為正常組和附子水提物低、中、高劑量組[0.45、0.9、1.8 g/（kg·d），以生藥量計算]，每組8只，分別灌胃水和相應(yīng)藥液0.1 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。末次給藥后，取大鼠十二指腸腸段，采用Western blotting法檢測腸組織中P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（Bcrp）、多藥耐藥蛋白2（Mrp2）為代表的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和密封蛋白（Claudin-1）、閉合蛋白（Occludin）、閉鎖小帶蛋白（ZO-1）為代表的緊密連接蛋白的表達(dá)水平;采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測定上述6種蛋白對應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，附子水提物各劑量組大鼠十二指腸組織中P-gp、Mrp2、Bcrp、Claudin-1、Occludin、ZO-1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;附子水提物各劑量組P-gp的mRNA表達(dá)水平，附子水提物低、高劑量組Bcrp的mRNA表達(dá)水平以及附子水提物中、高劑量組Claudin-1的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），其余基因的mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：附子水提物可從mRNA和/或蛋白水平上調(diào)3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和3種緊密連接蛋白的表達(dá)，從而可能與上述外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他底物類藥物以及以細(xì)胞旁路途徑為主要轉(zhuǎn)運(yùn)通道的藥物發(fā)生相互作用，在臨床上聯(lián)合用藥時可考慮對用藥劑量作相應(yīng)調(diào)整。

關(guān)鍵詞 附子;水提物;十二指腸;外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;緊密連接蛋白;細(xì)胞旁路;藥物相互作用;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Aconitum carmichaelii water extract on the expression of 3 kinds of efflux transporters and 3 kinds of tight junction proteins as well as their genes in duodenum tissues of rats. METHODS： Thirty-two SD male rats were randomly divided into normal group， A. carmichaelii water extract low-dose， medium-dose and high-dose groups [0.45， 0.9， 1.8 g/（kg·d）， by crude drug]， with 8 rats in each group. They were given water and relevant liquid 0.1 mL/kg intragastrically for consecutive 7 d. After last administration， the duodenal segments of rats were collected. Western blotting assay was used to detect the expression of efflux transporters as P-glycoprotein （P-gp）， breast cancer resistance protein （Bcrp）， multidrug resistance protein 2 （Mrp2） as well as tight junction proteins as Claudin-1， Occludin and ZO-1. mRNA expression of 6 kinds of proteins relevant gene were determined by qRT-PCR respectively. RESULTS： Compared with normal group， the protein expression of P-gp， Mrp2， Bcrp， Claudin-1， Occludin and ZO-1 in duodenum of rats were increased significantly in A. carmichaelii water extract groups （P<0.01）. mRNA expression of P-gp in A. carmichaelii water extract groups， mRNA expression of Bcrp in A. carmichaelii water extract low-dose and high-dose groups as well as mRNA expression of Claudin-1 in A. carmichaelli water extract medium-dose and high-dose groups were increased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. There was no statistical significance in mRNA expression of other genes （P>0.05）. CONCLUSIONS： A. carmichaelii water extract can up-regulate the expression of 3 kinds of efflux transporters and 3 kinds of tight junction proteins at the level of mRNA and/or protein， thus may interact with other substrates of the aforementioned efflux transporters and drugs with cell bypass pathway as the main transport pathway. In clinical practice， adjustment of dosage may be considered in drug combination.

KEYWORDS? ?Aconitum carmichaelii;Water extract; Duodenum; Efflux transporter; Tight junction protein; Cell bypass pathway; Drug interaction; Rat

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.）的子根及其加工品，有補(bǔ)火助陽、散寒止痛之功效，具有擴(kuò)張血管、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[1]，在臨床上廣泛用于治療心血管和消化系統(tǒng)疾病[2-3]。在臨床應(yīng)用時，附子常與其他中藥和/或化學(xué)藥聯(lián)用[3-5]，因此增加了藥物相互作用的機(jī)會。藥物相互作用會影響藥物的吸收，導(dǎo)致藥物血藥濃度發(fā)生變化，進(jìn)而對藥物的療效及毒性產(chǎn)生一定影響[6-7]，因此從吸收環(huán)節(jié)研究藥物的相互作用具有重要意義。

近年來，越來越多的研究表明，外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白在藥物吸收方面有著重要的地位[8]。以P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（Bcrp）和多藥耐藥蛋白2（Mrp2）為代表的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛分布于小腸、肝臟、腎臟及血腦屏障中，其能抑制相應(yīng)底物的吸收，在藥物相互作用中起重要作用[9-11]。緊密連接是溶質(zhì)通過旁細(xì)胞途徑擴(kuò)散的主要屏障[12]，主要由跨膜蛋白[如密封蛋白（Claudin-1）、閉合蛋白（Occludin）]和細(xì)胞質(zhì)蛋白[如閉鎖小帶蛋白（ZO-1）]等組成[13]。緊密連接蛋白表達(dá)的變化會導(dǎo)致細(xì)胞通透性的改變，而通透性的改變又會影響相應(yīng)藥物的吸收[14]。已有研究報道，附子活性成分對上述3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)有影響[15]，但由于臨床上附子通常以水提取物形式使用，而附子提取物對上述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響鮮見報道;同時，尚未見相關(guān)研究報道附子或其提取物對上述3種緊密連接蛋白表達(dá)的影響?；诖耍菊n題組以大鼠為研究對象，考察附子水提物對其十二指腸組織中上述3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和3種緊密連接蛋白及其對應(yīng)基因表達(dá)的影響，以探討附子水提物能否通過調(diào)控外排轉(zhuǎn)運(yùn)和旁細(xì)胞吸收途徑等機(jī)制影響藥物吸收，為附子與其他藥物在臨床的合理聯(lián)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

BS124S型電子分析天平（德國Sartorius公司）;R3002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州瑞涵儀器有限公司）;1260型高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司];3-18K型高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）;HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）;QYC-Z00型恒溫?fù)u床（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）;ELX800型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;ChemiDocTM凝膠成像儀（美國 Bio-Rad公司）;Bis-Tris Mini Gels型電泳槽、Mini Gel Tank型轉(zhuǎn)印槽（美國NuPAGE公司）;LightCycler?96型實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國Roche公司）。

1.2 藥品與試劑

兔源多克隆P-gp抗體、鼠源單克隆Mrp2抗體（美國Abcam公司，批號分別為ab170904、ab15603）;兔源多克隆Bcrp 抗體、兔源單克隆GAPDH抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號分別為BA3746-2、M00227-5）;兔源多克隆Claudin-1 抗體、兔源多克隆ZO-1抗體（美國Omnimabs公司，批號分別為OM247267、OM296184）;兔源多克隆Occludin 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司，批號：ET1701-76）;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔多克隆IgG（H+L）（二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：A0208）;Trizol LS試劑（美國Invitrogen公司，批號：10296010）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：AT341-02）;SYBR Green 試劑（北京聚合美生物科技有限公司）;PVDF膜（0.22 μm，美國Millipore公司）;BCA蛋白濃度試劑盒（批號：PC0020- 500）、彩虹180廣譜蛋白Marker（11～180 kDa，批號：PR1910）、總 RNA 提取試劑盒（批號：R1200-50T）、RT-PCR試劑盒（批號：RP1100）、RIPA裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液等均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司;上樣緩沖液、電泳液、轉(zhuǎn)膜液等均購自美國 Thermo Fisher Scientific公司;水為色譜級。

1.3 藥材

附子黑順片（批號：20150601）購自江西江中中藥飲片有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張壽文教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物烏頭（A. carmichaelii Debx.）的子根加工飲片。

1.4 動物

SPF級SD大鼠32只，雄性，體質(zhì)量為（200±20）g，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心屏障系統(tǒng)，動物使用許可證號：SYXK（贛）2017-0004。動物在環(huán)境溫度、濕度適宜的條件下進(jìn)行實驗，期間自由飲食。

2 方法

2.1 附子水提物浸膏的制備

取黑順片400 g，先后加入10、8倍量水（mL/g），分別加熱回流提取1 h，過濾;合并濾液，在40 ℃條件下高壓水浴旋蒸濃縮，冷凍干燥，制得附子水提物凍干粉浸膏（得率為3.4%），保存?zhèn)溆?。采用高效液相色譜法[16]檢測，所得浸膏中雙酯型生物堿含量（以次烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿含量合計）為0.4%，單酯型生物堿含量（以苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿含量合計）為4.56%。

2.2 分組及給藥

取大鼠32只，隨機(jī)分為正常組和附子水提物低、中、高劑量組[0.45、0.9、1.8 g/（kg·d），以生藥量計算;參照2015年版《中國藥典》（一部）中附子的服用劑量[17]，按等效劑量折算方法[18]計算并制定大鼠給藥劑量]，每組8只。除正常組大鼠灌胃相應(yīng)體積的水外，附子水提物各劑量組大鼠均灌胃相應(yīng)附子水提物浸膏藥液（以水為溶劑配制），給藥體積均為0.1 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。

2.3 生物樣本采集

給藥結(jié)束后，斷頸處死大鼠，在距其胃幽門部1 cm處量取十二指腸腸段10 cm，以液氮速凍后，立即于? ? ?-80 ℃條件下保存，備測。

2.4 大鼠十二指腸組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白的表達(dá)水平檢測

采用Western blotting法檢測目標(biāo)蛋白。取“2.3”項下采集的十二指腸腸段組織，以RIPA裂解液裂解后，12 000×g冷凍離心10 min，取上清液，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。取蛋白樣品適量，煮沸變性，在200 V恒壓下經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，再以300 mA恒流電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h;然后分別加入P-gp 抗體（1 ∶ 1 000）、Mrp2抗體（1 ∶ 20）、Bcrp 抗體（1 ∶ 100）、Claudin-1 抗體（1 ∶ 500）、Occludin 抗體（1 ∶ 1 000）、ZO-1 抗體（1 ∶ 500）、GAPDH抗體（1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育過夜;次日以TBST緩沖液洗滌10 min×3次，然后加入HRP標(biāo)記的二抗（1 ∶ 3 000），室溫孵育 1 h后，以TBST 洗滌10 min×3次;以ECL超敏化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)后，采用凝膠成像儀檢測。采用Image J 1.8.0軟件對蛋白條帶進(jìn)行圖像分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算各目標(biāo)蛋白的相對灰度值，用以表示蛋白表達(dá)水平。

2.5 大鼠十二指腸組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平檢測

采用實時定量PCR法檢測目標(biāo)基因mRNA。取“2.3”項下采集的大鼠十二指腸腸段組織，剪碎，以Trizol LS試劑盒提取總RNA，采用酶標(biāo)儀在260、280 nm波長處檢測吸光度并計算兩者比值（1.8～2.0即可）以考察RNA純度。取總RNA適量，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，然后在紫外光下觀察（可見清晰無拖帶的28 S、18 S、5 S等條帶即可）。取總 RNA 5 μg，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA并適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行PCR反應(yīng)?？偡磻?yīng)體系（共10 μL）：cDNA 2 μL、2×SYBR 5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、超純水1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃熱激變性10 min，95 ℃復(fù)性 5 s，60 ℃延伸10 s，72 ℃延伸15 s，共45個循環(huán)。以 GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt 法[19]計算P-gp、Mrp2、Bcrp、Claudin-1、Occludin、ZO-1的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有試驗至少獨(dú)立重復(fù)3次。采用 GraphPad 7.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均以x±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 附子水提物對大鼠十二指腸組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，附子水提物各劑量組大鼠十二指腸組織中P-gp、Mrp2、Bcrp蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠十二指腸組織中3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白電泳圖見圖1，蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。

3.2 附子水提物對大鼠十二指腸中3種緊密連接蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，附子水提物各劑量組大鼠十二指腸組織中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各組大鼠十二指腸組織中3種緊密連接蛋白電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果見表2。

3.3 附子水提物對大鼠十二指腸組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對應(yīng)基因mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，附子水提物各劑量組大鼠十二指腸組織中P-gp的mRNA表達(dá)水平，附子水提物低、高劑量組Bcrp的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其余基因的mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠十二指腸組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果見表3。

3.4 附子水提物對大鼠十二指腸組織中緊密連接蛋白對應(yīng)基因mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，附子水提物中、高劑量組大鼠十二指腸組織中Claudin-1 的mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;其余基因的mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠十二指腸組織中緊密連接蛋白對應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果見表3。

4 討論

中藥通常與其他中藥或/和化學(xué)藥物聯(lián)合使用，因此不同中藥之間或其與化學(xué)藥物間可能發(fā)生相互作用，并可能對臨床治療產(chǎn)生不同的影響[19-20]。外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白在口服藥物吸收途徑中均有很高的參與度[8]，因此其表達(dá)水平的變化對研究藥物間的相互作用十分重要。

本研究考察了附子水提取物對大鼠十二指腸組織中外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、Mrp2、Bcrp和緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、ZO-1的蛋白及其對應(yīng)基因表達(dá)的影響，旨在預(yù)測附子水提物與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他相關(guān)底物類藥物，以及以旁細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑為主要吸收通路的藥物之間的相互作用。

P-gp、Mrp2、Bcrp這3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)及活性變化可直接影響藥物在腸道環(huán)境中吸收情況[21]。據(jù)文獻(xiàn)報道，附子中的3種代表性烏頭類生物堿（烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、烏頭原堿）可明顯上調(diào)人結(jié)腸腺癌LS174T細(xì)胞、Caco-2 細(xì)胞以及 FVB 小鼠小腸組織中P-gp、Mrp2和Bcrp的表達(dá)，其中除烏頭原堿能明顯降低結(jié)腸段中Bcrp的mRNA表達(dá)水平，但對其蛋白影響不顯著之外，上述3種生物堿對其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其mRNA的調(diào)控作用基本一致，并認(rèn)為烏頭類生物堿與P-gp、Mrp2、Bcrp其他底物類藥物聯(lián)用時可能發(fā)生相互作用[22-24]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的附子水提取物均可明顯上調(diào)大鼠十二指腸組織中上述3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中對P-gp、Bcrp蛋白表達(dá)水平的影響與其對應(yīng)基因的影響具有一致性，與附子中的3種代表性生物堿在不同生物樣本上的影響總體上保持一致，因此推測附子水提物與上述3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他底物類藥物也可能發(fā)生相互作用。附子作為一種具有抗腫瘤活性的中藥，當(dāng)與紫杉醇、阿霉素、長春新堿等同屬于P-gp底物的抗腫瘤藥物[25-26]聯(lián)合應(yīng)用時，其對外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的上調(diào)作用可能導(dǎo)致上述藥物血藥濃度降低，從而降低上述藥物的療效。因此，當(dāng)臨床上將附子水提物與其他外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物類藥物聯(lián)用時應(yīng)注意外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的變化，并可能需要相應(yīng)增大臨床給藥劑量，但具體劑量調(diào)整情況還需臨床研究進(jìn)行驗證。

緊密連接是許多非載體介導(dǎo)的水溶性成分的重要吸收途徑之一，其上皮細(xì)胞吸收主要是通過旁細(xì)胞途徑，該結(jié)構(gòu)十分致密，而上調(diào)Claudin-1、Occludin、ZO-1的表達(dá)可明顯影響旁細(xì)胞途徑對藥物的吸收[27]。本研究結(jié)果顯示，附子水提取物可明顯上調(diào)Claudin-1、Occludin、ZO-1等緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，推測其與以細(xì)胞旁路途徑為主要轉(zhuǎn)運(yùn)通道的藥物可能在吸收環(huán)節(jié)發(fā)生相互作用。例如，有研究報道，阿司匹林和水楊酸可以通過破壞緊密連接蛋白、打開細(xì)胞間隙，從而增加三七皂苷的吸收[28];化療藥物如西莫替尼可通過破壞緊密連接、打開細(xì)胞間隙來增加聯(lián)用藥物的吸收，從而提高頭孢克洛、瓦拉昔洛韋和阿昔洛韋的細(xì)胞旁路吸收[7]。附子作為一種具有抗炎和抗腫瘤藥理活性的中藥，當(dāng)與上述抗炎或抗腫瘤藥物聯(lián)用時，也應(yīng)當(dāng)注意其對配伍藥物吸收的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，附子水提物對Claudin-1的mRNA表達(dá)水平的顯著上調(diào)作用與其對相應(yīng)蛋白的影響基本一致，但是對Occludin、ZO-1的mRNA表達(dá)水平無顯著上調(diào)作用，與其對相應(yīng)蛋白的顯著上調(diào)作用并不完全一致。這提示，附子水提物可能是通過促進(jìn)上述2種蛋白相應(yīng)基因的mRNA翻譯或者提高其蛋白的穩(wěn)定性，而不是通過促進(jìn)其基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮作用。

綜上所述，附子水提物可從mRNA和/或蛋白水平上調(diào)3種外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和3種緊密連接蛋白相應(yīng)基因的表達(dá)，從而與上述外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的其他底物類藥物以及以細(xì)胞旁路途徑為主要轉(zhuǎn)運(yùn)通道的藥物發(fā)生相互作用，繼而影響上述藥物的血藥濃度乃至藥效。在臨床上聯(lián)合用藥時有必要考慮這種相互作用，并可考慮對用藥劑量作相應(yīng)調(diào)整。關(guān)于外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接相關(guān)蛋白基因表達(dá)水平的變化具體如何反映藥物聯(lián)用時血藥濃度及藥物效應(yīng)的變化，尚待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2019-03-18 修回日期：2019-08-29）

（編輯：段思怡）