食品成分對脲酶活性的影響

趙國群，張寧寧

（1.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050018；2.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

食品的重金屬污染是最受關(guān)注的食品安全問題之一。從食品安全方面考慮的重金屬污染，目前最引人關(guān)注的是鉛、汞、鉻、鎘，以及類金屬砷等有顯著生物毒性的重金屬[1]。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、原子發(fā)射光譜法和陽極溶出伏安法等[2]。這些檢測方法雖然靈敏度比較高，但是檢測儀器昂貴，檢測步驟繁瑣，耗時長，檢測成本較高，難以滿足市售食品的現(xiàn)場抽查、食品生產(chǎn)企業(yè)自查的要求[3-4]。研究簡單、快速和低成本的重金屬快速檢測方法，對于監(jiān)控食品的重金屬污染具有重要意義。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對環(huán)境及食品中重金屬的快速檢測技術(shù)進行了許多研究，其中酶抑制法檢測重金屬是最受關(guān)注的方法之一。酶抑制法測定重金屬的基本原理是：重金屬離子與酶活性中心的某些部位如巰基結(jié)合，酶活性中心的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活力下降，從而使底物-酶系統(tǒng)產(chǎn)生變化，例如使顯色劑的顏色、溶液的吸光度、pH和電導(dǎo)率等發(fā)生改變，直接用肉眼或通過電信號、光信號檢測這些變化，即可判斷樣品中是否存在重金屬[5-6]。由于脲酶對重金屬離子高度的選擇性和敏感性，而且廉價易得[7-9]，因此，在酶抑制法檢測重金屬的研究中使用最多。雖然酶抑制法檢測重金屬的研究已經(jīng)有了較大的進展，但是僅限于環(huán)境樣品，很少涉及食品樣品的檢測，這是因為食品種類繁多，成分復(fù)雜，可干擾酶法檢測效果的因素很多[5]。造成這種現(xiàn)象的原因之一是有關(guān)食品成分與脲酶酶活之間關(guān)系的研究極少。本文采用模擬的方法，研究了糖、蛋白質(zhì)、有機酸色素等食品成分對脲酶酶活的影響，以期為酶法檢測食品中重金屬的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、果糖、檸檬酸：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；蔗糖：天津市百世化工有限公司；可溶性淀粉：張家口市茶坊化學(xué)試劑廠；安賽蜜（食品級）：山東明輝食品有限公司；酪蛋白（食品級）、甘氨酸、L-半胱氨酸、谷氨酸、酒石酸、氯化鈉、山梨酸鉀（食品級）、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉：天津博迪化工有限公司；明膠（食品級）：上海市化學(xué)試劑公司工廠；乳酸、無水乙酸、乙酸鈉、酒石酸鉀鈉：天津永大化學(xué)試劑有限公司；磷酸：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；檸檬酸三鈉：天津市標準科技有限公司；色素（食品級）：莧菜紅、赤蘚紅、胭脂紅、檸檬黃、日落黃、甜蜜素（食品級）：天津市光復(fù)精細化工研究所；兒茶酚：天津市大茂化學(xué)試劑廠。如沒有特別指出，上述食品成分材料均為分析純。

Jack bean urease脲酶：美國Sigma公司，酶活力為 15000 U/mg；尿素、苯酚、亞硝基鐵氰化鈉、次氯酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CS501超級恒溫水浴鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；SP-752分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑的配制

1）脲酶溶液的配制：精確稱取脲酶0.001 g，溶于磷酸鹽緩沖溶液（pH7.0）中，并定容至250 mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2）酚顯色劑：稱取苯酚5.00 g，亞硝基鐵氰化鈉（含2分子結(jié)晶水）0.025 g，溶于去離子水中并定容至500 mL。

3）堿性次氯酸鈉溶液：稱取氫氧化鈉2.50 g，溶于去離子水中，加入安替福明4 mL，在棕色容量瓶定容至500 mL。

4）3%尿素溶液：精確稱取尿素3.00 g，溶于去離子水，定容至100 mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脲酶酶活力測定

脲酶酶活力測定原理：脲酶催化尿素水解產(chǎn)生2分子氨和1分子二氧化碳[10]；氨在堿性條件下與苯酚及次氯酸鈉反應(yīng)，生成藍色的靛酚，并在671 nm下有吸收峰。在一定范圍內(nèi)，靛酚呈色深淺與氨含量成正比[11-12]。

取3%尿素2 mL溶液于試管中，分別加入1 mL所配制的食品成分溶液、1 mL去離子水和1 mL脲酶溶液，搖勻后于30℃水浴下反應(yīng)20 min。反應(yīng)結(jié)束后加入5 mL酚顯色劑，搖勻，再加入5 mL堿性次氯酸鈉溶液，充分搖勻后于30℃水浴下顯色30 min。顯色結(jié)束后于671 nm下測定吸光度，計算脲酶酶活。脲酶酶活力單位定義為：在pH7.0，30℃下，每分鐘催化產(chǎn)生0.01 μmoL NH3的酶量為一個活力單位。

1.3.3 脲酶酶活抑制率的計算

脲酶酶活抑制率=（去離子水酶活－食品成分酶活）/去離子水酶活×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 糖類及甜味劑對脲酶活性的影響

糖及甜味劑是廣泛應(yīng)用于果汁、果醬、蜜餞類、飲料、果凍、糕點等各類食品中，是食品中最常見的成分之一。用去離子水分別配制5%葡萄糖、5%果糖、5%蔗糖、0.5%可溶性淀粉、0.065%甜蜜素和0.03%安賽蜜溶液，然后與脲酶溶液混合，以去離子水為對照，測定脲酶酶活，試驗結(jié)果見圖1。

圖1 糖類及甜味劑對脲酶活性的影響Fig.1 Effect of sugars and sweeteners on urease activity

從圖1可以看出，如預(yù)料的那樣，葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉均對脲酶沒有表現(xiàn)出抑制作用。然而，人工甜味劑甜蜜素和安賽蜜卻對脲酶有明顯的抑制作用，二者的酶活抑制率分別為34.6%和29.0%。為了降低生產(chǎn)成本，甜蜜素等甜味劑在果汁飲料、碳酸飲料和冷飲中廣泛添加。如果采用脲酶抑制法測定其中的重金屬，如果不采取其他措施，就會造成假陽性，引起誤判。從圖1中還發(fā)現(xiàn)，與分析純的葡萄糖不同，食品級的口服葡萄糖對脲酶酶活表現(xiàn)出了非常顯著的抑制作用，其酶活抑制率達55.4%。造成這種現(xiàn)象的原因應(yīng)是其純度較低，含有較高的金屬離子所致，這也從另一個側(cè)面說明脲酶對金屬離子的高敏感性。

2.2 蛋白質(zhì)及氨基酸對脲酶活性的影響

蛋白質(zhì)及氨基酸也是食品中最常見的成分之一，尤其是乳粉、豆制品、肉制品，其中含有豐富的蛋白質(zhì)及氨基酸。用去離子水分別配制0.5%酪蛋白、2%明膠、0.2%谷氨酸、0.01%甘氨酸、0.01%L-半胱氨酸溶液，與脲酶溶液混合，以去離子水為對照，測定脲酶酶活，試驗結(jié)果見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)及氨基酸對脲酶活性的影響Fig.2 Effect of proteins and amino acids on urease activity

酪蛋白是乳粉中的主要蛋白質(zhì)之一[13]；明膠常用于果凍等食品。從圖2中發(fā)現(xiàn)，這兩種蛋白質(zhì)對脲酶具有顯著的抑制作用，其酶活抑制率分別為32.5%和56.2%。根據(jù)脲酶酶活性中心的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)進行分析，純酪蛋白、明膠應(yīng)不會對脲酶有抑制作用。根據(jù)2.1中分析純葡萄糖與食品級口服葡萄糖的試驗結(jié)果，可以推斷造成這種現(xiàn)象的實際原因應(yīng)是：試驗中所使用的樣品是食品級的，其中雜質(zhì)如無機鹽較多，這些雜質(zhì)造成了對脲酶的抑制。谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸均表現(xiàn)出抑制作用。脲酶酶活的最適pH為7.0，而谷氨酸、甘氨酸、L-半胱氨酸溶液均呈微酸性，反應(yīng)體系的微酸性是造成所試氨基酸顯示抑制作用的原因之一。

2.3 有機酸及其鹽對脲酶活性的影響

果汁、果醋、果酒中含有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、草酸、琥珀酸及醋酸等有機酸；酸奶及其飲料含有的有機酸主要是乳酸；在可樂類飲料中，使用的主要是磷酸。用去離子水分別配制0.02%酒石酸、0.03%蘋果酸、0.15%檸檬酸、0.3%乙酸、0.2%乳酸、0.1%磷酸及其這些有機酸的鈉鹽溶液，與脲酶溶液混合，以去離子水為對照，測定脲酶酶活，試驗結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 有機酸對脲酶活性的影響Fig.3 Effect of organic acids on urease activity

圖4 有機酸鹽對脲酶活性的影響Fig.4 Effect of organic acid salts on urease activity

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸、乳酸和磷酸均表現(xiàn)出對脲酶的抑制作用，其抑制程度因有機酸的種類和濃度而異。乙酸的抑制作用最大可能與使用的濃度最大有關(guān)。將圖3與圖4進行比較，發(fā)現(xiàn)檸檬酸三鈉對脲酶沒有抑制作用，蘋果酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉和磷酸鈉與相應(yīng)的酸相比，對脲酶的抑制作用均減小。例如，乳酸的酶活抑制率為26.9%，而乳酸鈉的酶活抑制率為15.3%。這個試驗結(jié)果表明，有機酸對脲酶的抑制作用主要是由于有機酸的低pH所引起的。因此，在采用脲酶法檢測食品中重金屬時，首先將食品樣品溶液的pH調(diào)為脲酶的最適pH，可減少有機酸的干擾，提高檢測的準確度。

2.4 色素對脲酶活性的影響

天然色素成本高，而且其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易褪色，相比之下，合成色素色彩鮮艷，著色力好，易溶于水，而且價格也便宜，所以人工合成色素在食品中被廣泛應(yīng)用[14]。用去離子水分別配制0.005%赤蘚紅、0. 0025%胭脂紅、0.01%檸檬黃、0.01%日落黃和0.024%莧菜紅溶液，與脲酶溶液混合，以去離子水為對照，測定脲酶酶活，試驗結(jié)果見圖5。

圖5 色素對脲酶活性的影響Fig.5 Effect of pigments on urease activity

如圖5所示，5種人工合成色素均對脲酶既沒有抑制作用，也沒有激活作用。這個結(jié)果表明，在采用脲酶法檢測食品中重金屬時，可不考慮人工合成色素的影響。

2.5 其它食品成分對脲酶活性的影響

由于食品中成分復(fù)雜多樣，本試驗選取了幾種食品中常見的其它成分，研究了它們對脲酶活性的影響。圖6是0.02%氯化鈉、0.03%兒茶酚、0.1%山梨酸鉀、0.1%苯甲酸鈉和0.015%亞硝酸鈉溶液對脲酶酶活的影響，見圖6。

圖6 其它食品成分對脲酶活性的影響Fig.6 Effect of other food components on urease activity

氯化鈉存在于許多食品中。在本試驗條件下，0.02%氯化鈉對脲酶酶活沒有影響。然而，在某些食品如咸菜中含有很高濃度的食鹽，高濃度的氯化鈉是否對脲酶酶活有影響還有待進一步研究。山梨酸鉀和苯甲酸鈉是兩種食品中常用的防腐劑，其最高允許用量均為0.1%。如圖6所示，二者也對脲酶酶活沒有影響。亞硝酸鈉是肉制品的常用發(fā)色劑[15]。亞硝酸鈉對脲酶酶活有明顯的抑制作用，其酶活抑制率為18%。茶葉中含有大量的茶多酚[16-17]，許多水果如蘋果、桃、李、葡萄等都含有一定量的多酚物質(zhì)。這些多酚物質(zhì)基本上可分為簡單酚類、酚酸類和黃酮類化合物等。其中，簡單酚類物質(zhì)含量較少，主要包括兒茶酚、對苯二酚和間苯二酚等[18]。從圖6中可以發(fā)現(xiàn)，兒茶酚對脲酶具有強烈的抑制作用，其酶活抑制率達到83.6%，這與黃光佛的研究結(jié)果一致[19]。邱業(yè)先[20]等也發(fā)現(xiàn)茶多酚對脲酶具有較強的抑制作用。脲酶是一種含鎳酶，它有129個半胱氨酰基，47個巰基，其中有4～8個巰基對酶的活性具有重要意義，而酚類物質(zhì)主要作用于對脲酶活性具有重要意義的巰基[21]。鑒于此結(jié)果，脲酶抑制法恐很難用于檢測茶飲料中的重金屬。

3 結(jié)論

本試驗采用模擬的方法，研究糖、蛋白質(zhì)、有機酸、色素等食品成分對脲酶酶活的影響。研究結(jié)果表明：

1）葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉對脲酶沒有抑制作用，而甜蜜素和安賽蜜卻對脲酶有明顯的抑制作用。

2）谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸表現(xiàn)出抑制作用。酪蛋白和明膠也具有顯著的抑制作用，但其實際原因應(yīng)是二者含有的較多雜質(zhì)如無機鹽所致。

3）酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乙酸、乳酸和磷酸均表現(xiàn)出對脲酶的抑制作用，其抑制程度因有機酸的種類和濃度而異。有機酸對脲酶的抑制作用主要是由于有機酸的低pH所引起的。這些有機酸生成相應(yīng)的鹽后，它們對脲酶的抑制作用顯著降低。

4）赤蘚紅、胭脂紅、檸檬黃、日落黃和莧菜紅對脲酶活性沒有影響。

5）氯化鈉、山梨酸鉀和苯甲酸鈉對脲酶活性沒有影響，而兒茶酚和亞硝酸鈉對脲酶有明顯的抑制作用，尤其是0.03%兒茶酚，其酶活抑制率達到83.6%。

綜上所述，一些食品成分對脲酶有抑制作用。如果采用脲酶抑制法測定其中的重金屬，就容易造成假陽性，使得檢測結(jié)果不準確。那么如何克服這一難題呢？每個食品生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品，盡管由于各種原輔料來源不同，其食品成分會有波動，但是每個產(chǎn)品都有其質(zhì)量標準（國家標準或企業(yè)標準），因此其成分還是基本穩(wěn)定的。如果對一個食品企業(yè)的產(chǎn)品建立一個數(shù)據(jù)庫，確定其正常的脲酶酶活范圍。如果發(fā)現(xiàn)某個食品樣品的脲酶酶活超標，就意味著其重金屬超標。這時再采用其他儀器復(fù)查，就能及時發(fā)現(xiàn)重金屬污染事件。因此，作為重金屬的快檢方法，脲酶抑制法仍是可行的。根據(jù)本試驗結(jié)果，脲酶抑制法最適合于檢測生活飲用水、礦泉水和純凈水中的重金屬。通過測定前溶液pH調(diào)整值，脲酶抑制法還可以用于檢測碳酸飲料中的重金屬。本試驗僅研究了單一食品成分單一濃度對脲酶活性的影響，混合食品成分及其濃度對脲酶活性的影響還有待研究。此外，更多的食品成分如增稠劑、乳化劑等也有待研究。

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