響應(yīng)面優(yōu)化柚皮苷酶對長壩柚汁的脫苦工藝

肖仔君，文淑儀，唐輝，鐘瑞敏

（韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

柚皮苷是柚汁中的苦味物質(zhì)，是一種黃烷酮糖苷類化合物，由柚皮素-7-p-D-葡萄糖-α-L-鼠李糖構(gòu)成，分子式為C27H32O14·2H2O，相對分子質(zhì)量為616.58。柚皮苷易溶于熱乙醇中，在熱水和熱乙酸中可溶，冷水和冷乙醇中微溶，乙醚、氯仿、苯中不溶[1]。隨著我國經(jīng)濟和人們生活水平的提高，對柑橘汁的需求量也呈現(xiàn)快速增長。然而柑橘類水果在其果汁加工過程中，由于經(jīng)過榨汁、熱加工等工藝處理，苦味物質(zhì)被釋放出來，使得柑橘汁的口感大大下降。另一方面，這些苦味物質(zhì)是保持產(chǎn)品特有風(fēng)味必不可少的，但苦味過強就會影響產(chǎn)品的口感、質(zhì)量和銷售。所以柑橘類果汁的脫苦是柑橘類水果深加工的關(guān)鍵技術(shù)。

目前柑橘類果汁中苦味物質(zhì)的脫除方法主要有以下幾種，如：屏蔽脫苦法，陳藝暉[2]等以0.6%β-環(huán)糊精脫除柚皮苷的效率為87.21%。此外，還有固定化細胞脫苦、超臨界脫苦、膜分離脫苦、酶法脫苦、吸附脫苦、基因工程脫苦等方法[3-8]。其中酶法脫苦具有操作簡單、作用條件溫和、脫苦效率高、專一性強、便于應(yīng)用等優(yōu)點，是目前最具有發(fā)展的脫苦方法之一[6]。

柚皮苷酶由α-L-鼠李糖苷酶（EC3.2.1.40）和β-D-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）組成的一個酶系，是一種胞外酶。柚皮苷首先被α-L-鼠李糖苷酶水解成略有澀味但無苦味的櫻桃苷（Prunin）和鼠李糖（Rhamnose），櫻桃苷（Prunin）的苦味是柚皮苷的1/3，苦味有所減輕。然后在櫻桃苷（Prunin）在β-D-葡萄糖苷酶的作用下變成無苦味的柚皮素（Naringenin）和葡萄糖（Glucose）[3]。本試驗主要研究了柚苷酶脫去長壩沙田柚果汁苦味物質(zhì)的工藝參數(shù)，為今后長壩沙田柚汁脫苦的工藝技術(shù)提供技術(shù)參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

長壩沙田柚：采摘于韶關(guān)市金柚公司的果場。柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品：購于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，純度在99.8%以上；柚苷酶，600 IU/g：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。

二甘醇、磷酸氫二鉀、無水乙醇、硝酸鉀、檸檬酸、氫氧化鈉均為分析純。

772N可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；HH-S28S數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市大地自動化儀器廠；分析天平BS124S：北京賽多利斯天平有限公司；TGL-16C臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計pHS-3C型：上海精密雷磁公司。

1.2 柚汁制備工藝

柚子→去皮→破碎→榨汁→加入果膠酶→攪勻→抽濾→離心（ 4000 r/min、10 min）→原果汁

1.3 方法

1.3.1 單因素實驗

按照實驗方法，分別以反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、酶用量以及pH為影響因素，設(shè)置4個因素來確定相關(guān)因素對柚苷酶脫苦效率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，選取反應(yīng)時間（A）、反應(yīng)溫度（B）和酶用量（C）為實驗因素，以柚皮苷的脫苦率為實驗指標(biāo)，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗[10-11]，其水平編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Factors and the levels of experiment of response surface analysis

1.4 分析方法

1.4.1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品在110℃下干燥至恒重，稱取20.0 mg，添加0.1 mol/L的NaOH 20 mL使其完全溶解后，用檸檬酸調(diào)至pH至6，定容至100 mL，得柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋2.5倍得0.08 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液溶液，同時再作一空白液作標(biāo)準(zhǔn)稀釋用。分別吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的0.08 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液，于6 支試管中，分別添加空白液 5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 和0.0 mL，再各加90%二甘醇5.0 mL和4 mol/L NaOH 0.1 mL，置于40℃恒溫水浴保溫條件下進行顯色反應(yīng)10 min，然后立即注入1 cm比色皿內(nèi)，在420 nm的波長處測吸光度。以吸光度對標(biāo)樣柚皮苷含量作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 1[3，9，12]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

1.4.2 樣液的測定

取2 mL果汁和pH 3.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.9 mL置于試管中，在40℃恒溫水浴中預(yù)熱4 min～5 min，然后加入酶液0.1 mL，充分搖勻，準(zhǔn)確保溫30 min，迅速吸取0.1 mL，置于15 mL比色管中，加入90%—縮二乙二醇5 mL，蒸餾水0.4 mL和1 mol/L NaOH溶液0.5 mL，搖勻，在30℃保溫30 min。倒入比色皿中，在420 nm波長下測定吸光度[9]。

式中：C1為由待測液吸光值在標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得的柚皮苷含量，（mg/L）；V1為樣液測定時溶液的總體積，mL；V為量取得待測液體積，mL。

1.5 感官評定[13]

挑選10名食品專業(yè)人員進行脫苦前后柚汁的感官評價，以5分記（苦味強烈記0～1分、有苦味，無柚汁濃郁香味記2分～3分、無感官苦味，明顯品嘗出柚汁濃郁香味記4分～5分）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

脫苦率是表示柚皮苷酶解的程度。在柚苷酶的作用下，使柚皮苷酶解成無苦味物質(zhì)，若柚皮苷被酶解的越多，那么果汁中的柚皮苷所剩余的量就越少，苦味越低，吸光值也越來越小，脫苦率則越高。

式中：C為酶解前果汁中柚皮苷的含量，（mg/L）；C1為酶解后果汁中柚皮苷的含量，（mg/L）。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解時間對脫苦效果的影響

首先研究酶解時間對柚汁脫苦效率的影響，在柚汁的自然pH下，酶解溫度為40℃，酶用量為0.5 g/L的條件下進行柚汁脫苦研究結(jié)果見圖2。

圖2 酶解時間對脫苦效果的影響Fig.2 The effect of reaction time on debittering

從圖2可知，脫苦率先是隨著時間的延長脫苦效率增大，在150 min時達到了最大值，隨后，脫苦率又開始稍許降低。這可能是因為隨著酶解時間延長，柚皮苷減少，產(chǎn)物增多，逆反應(yīng)增強；也可能隨著酶解時間延長，柚汁中含有的柚皮苷慢慢溶出，導(dǎo)致整個體系中柚皮苷增大，脫苦率表現(xiàn)為下降趨勢[14]。綜合考慮，酶解時間為150 min較為合適。

2.2 酶解溫度對脫苦效果的影響

在柚汁自然pH，酶解時間為150 min，酶用量為0.5 g/L，不同的酶解溫度條件下進行柚汁脫苦研究結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解溫度對脫苦效果的影響Fig.3 The effect of reaction temperature on debittering

從圖3中知，脫苦效果先是隨著溫度的升高而升高，溫度達到50℃時脫苦效果最高，之后隨著溫度的升高，脫苦效果有所降低。其實溫度對柚苷酶的酶促反應(yīng)的影響有兩方面：一方面是當(dāng)溫度升高時，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度也加快；另一方面，隨溫度升高而使柚苷酶逐步變性，從而降低酶的活性[15]。因此，隨著反應(yīng)溫度升高，酶開始失活，影響了酶解反應(yīng)的產(chǎn)率。試驗結(jié)果表明50℃的酶解溫度是較適宜的。

2.3 酶用量對脫苦效果的影響

在柚汁自然pH，酶解時間為150 min，酶解溫度為50℃，添加不同劑量的酶液的條件下進行柚汁脫苦研究結(jié)果見圖4。

圖4 酶用量對脫苦效果的影響Fig.4 The effect of naringinase usage on debittering

酶用量對脫苦研究有較大的影響，若酶用量不足，那么反應(yīng)底物充足，柚皮苷水解不能完全，脫苦率不高，若酶用量過多，底物濃度相對降低，則反應(yīng)物與酶接觸不充分，并且酶與酶之間也會產(chǎn)生競爭性抑制，使脫苦率下降。從圖4中可以看出，在酶用量小于0.5 g/L時，脫苦率隨酶用量的增加而增大；酶用量增加到0.5 g/L時，脫苦率最大，接著在酶用量0.6、0.7、0.8 g/L時逐漸下降，酶用量大于0.8 g/L時脫苦率稍微呈向上的趨勢，基本變化不大。綜合考慮，酶用量為0.5 g/L時脫苦效率較好。

2.4 果汁的pH對脫苦效果的影響

在柚汁酶解時間為150 min，酶用量為0.5 g/L，酶解溫度為50℃，不同柚汁pH的條件下進行柚汁脫苦研究結(jié)果見圖5。

圖5 果汁的pH對酶法脫苦的影響Fig.5 The effect of pH of juice on debittering

每種酶都有最適pH，在最適pH下翠花反應(yīng)的速率最快。過高或過低的pH都會影響酶蛋白的構(gòu)象，影響底物和酶活性中心部位基團的解離，從而影響酶反應(yīng)的速度，甚至使酶變性而失活。從圖5中可以看出當(dāng)pH為4.0之前，脫苦率都隨著pH的升高而提高，pH大于4.0后，柚汁脫苦率就逐步下降。所以實驗選擇適宜的pH為4.0。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗中，各因素對脫苦率的影響程度，結(jié)合實際試驗操作，選取其中3個對脫苦率影響較大的的因素來作為響應(yīng)面的因素，即：時間、溫度、酶用量。

采用Design-expert 7.1.6軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，共產(chǎn)生了17個實驗，其中12個實驗為析因?qū)嶒灒?個為中心試驗以估計誤差。分析方案及結(jié)果如下表2所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 2 Observed and estimated values for different levels of experimental design

回歸方程的建立及方差分析如下。

采用Design-expert 7.1.6軟件對表3中數(shù)據(jù)進行回歸分析，建立響應(yīng)面回歸模型：Y=51.44-0.087A+1.163B+0.275C-1.050AB-0.775AC+0.375BC-2.220A2-2.920B2-0.095C2。

因素的ANOVA分析結(jié)果見表3。

由表3可知，模型的“Prob＞F”值小于 0.01，表明二次方程擬合顯著，失擬項F值大于0.05，表明失擬項相對于絕對誤差是不顯著的。即各因素值和響應(yīng)面之間的關(guān)系可以用此模型來函數(shù)化。從表3中的P值得知，B、AB 對柚皮苷的脫苦率為顯著（P＜0.05），A2、B2對柚皮苷的脫苦率為高度顯著（P＜0.01）。由此可以見，各具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。而且，本實驗的回歸方程也是顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=0. 9199，說明響應(yīng)面（脫苦率）的變化有91.99%來源于所選變量，即反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和酶用量。因此，回歸方程可以較好的描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用回歸方程確定最佳提取工藝條件。

表3 回歸方程分析Table 3 Analyze of mean square

2.5.1 響應(yīng)面交互及優(yōu)化

根據(jù)表3的回歸模型方差分析結(jié)果，作出相應(yīng)的響應(yīng)面，如圖6～圖8，比較三圖可知，酶解溫度是影響柚汁脫苦的主要因素，酶解時間與酶解溫度交互影響為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。酶用量和酶解溫度與酶解時間的交互都不顯著，由等高線圖可看出，擬合面柚皮苷脫苦率最高值存在，說明各因素都有一個對應(yīng)的最適值存在。

圖6 酶解溫度與酶解時間的交互影響Fig.6 Response surface of interrelated influence of hydrolysis temperature and hydrolysis time to debittering rate

圖7 酶用量與酶解時間的交互影響Fig.7 Response surface of interrelated influence of the amount of enzyme and hydrolysis time to debittering rate

圖8 酶用量與酶解溫度的交互影響Fig.8 Response surface of interrelated influence of the amount of enzyme and hydrolysis temperature to debittering rate

通過回歸模型預(yù)測的柚皮苷酶解工藝最佳條件為：酶解溫度為53.1℃，酶解時間為141.9 min量為0.5 mL。在此條件下，脫苦率理論上可以達到52.0%，考慮到實際操作的可行性，將回歸方程得到的理論值修正為：酶解溫度為53℃，酶解時間為142 min，酶用量為0.5 g/L。

2.5.2 驗證實驗結(jié)果

為了驗證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，按照上述結(jié)論（酶解溫度為53℃，酶解時間為142 min，酶用量為0.5 g/L在此酶解條件下重復(fù)3次實驗，測定其脫苦率，并進行感官評定其平均脫苦率為51.5%，與理論值相差甚微。說明采用響應(yīng)面得到的柚皮苷酶對柚子汁脫苦的工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的，具有一定的實際價值。另外，通過感官評定，脫苦前與脫苦后感官有明顯的差異，脫苦前，感官評價在0.6分，有強烈的苦味，脫苦后，感官分值較高，達4.0分（以5分記），無明顯的苦味，并能品嘗出柚汁濃郁的香味。由此可說明用柚皮苷酶對對長壩柚汁進行脫苦具有實際應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

以長壩柚子為原料，選擇柚皮苷酶對長壩柚子的脫苦率為指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對柚皮苷酶的脫苦工藝進行研究，確定最佳脫苦工藝為：柚苷酶的添加量為0.5 g/L，酶解溫度為53℃，酶解時間為142 min，柚汁的pH為4，在此條件下脫苦率達到51.5%。

[1] Johnson R L,Chandler B V.Adsorptive removal of bitterprinciples and tritratables and tritratable acid from citrus juices[J].Food Technology,1988,42(5)：130－137

[2] 陳藝暉,林河通,鄭俊峰,等.金柑果汁加工中的脫苦工藝研究[J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(3)：564-567

[3] 王鴻飛,李和生,董明敏,等.柚皮苷酶對柑橘類果汁脫苦效果的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2004,20(6)：174-177

[4] 文蓉,黎繼烈,崔培梧,等.柑桔類果汁的酶法脫苦研究進展[J].北方園藝,2009(3)：130-133

[5] 黃高凌,倪輝,胡陽,等.柚皮苷酶對瑁溪蜜柚果汁脫苦效果工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué),2010,31(8)：70-73

[6] Sekeroglu G,Fadiloglu S,Gogus F.Immobilization andcharacterization of naringinase for the hydrolysis of naringin[J].European Food Research and Technology,2006,224(1)：55-60

[7] Busto M D,Meza V,Ortega N,et al.Immobilization of naringinase from Aspergillus niger CECT 2088 in poly(vinylalcoho1)eryogels for thedebitteringofjuices[J].FoodChemistry,2007,104(3)：1177-1182

[8]姚輝.產(chǎn)柚苷酶菌株的選育及柚子汁酶法脫苦工藝的研究[D].福建：福建農(nóng)林大學(xué),2009：2-7

[9] 劉偉.生物酶法脫除柑橘汁苦味的研究[D].湖南：中南大學(xué),2009：2-16

[10]曾霖霖,黃惠華.響應(yīng)曲面法優(yōu)化柚皮苷酶對金桔汁的脫苦工藝[J].食品工業(yè)科技,2011,32(5)：315-318

[11]劉軍海,黃寶旭,將德超.響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉多糖提取工藝研究[J].食品科學(xué),2009,30(2)：114-118

[12]Davis W.B.Determination of flavanones in citrus fruits[J].Analytical Chemistry,1947,19(7)：476-478

[13]唐輝,肖仔君,鐘瑞敏,等.大孔樹脂對長壩柚汁脫苦工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(23)：276-280

[14]趙力斌.固定化柚苷酶及其對桔子汁脫苦的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1987(1)：15-34

[15]張碌晶,袁敏,管遠紅,等.不同溫度、pH和無機離子對黑曲霉A66菌株產(chǎn)柚苷酶活力影響的初步研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,28(3)：449-452