螺旋藻多糖抗H 22腫瘤作用研究

陳宏碩，李曉穎，馮鵬棉，柏松，高建勝

（1.河北聯(lián)合大學電氣工程學院，河北唐山063009；2.河北聯(lián)合大學公共衛(wèi)生學院，河北唐山063009；3.河北聯(lián)合大學冀唐學院，河北唐山063009）

螺旋藻是一種微藻類古老生物，屬于藍藻門，顫藻科。螺旋藻不僅營養(yǎng)價值很高，且其含有的大量生物活性物質(zhì)對人體非常有益，其中最引人注目的是螺旋藻多糖。螺旋藻多糖是從螺旋藻藻體、螺旋藻培養(yǎng)液中提取分離出來的水溶性多糖，是一類具有促進細胞生長、抗輻射、抗衰老、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)活性、促進蛋白質(zhì)合成等功能的天然生物活性物質(zhì)[1-3]。尤其近年來研究報道螺旋藻多糖具有良好的抗腫瘤作用，并且它還是天然化合物，具有無毒、高效的特點。

因此，對于研究其抗腫瘤作用及機制變得越來越重要。本文就螺旋藻多糖抗小鼠H22腫瘤作用進行初步研究，旨在探討螺旋藻多糖其抗腫瘤作用及機制，從而為進一步研究開發(fā)螺旋藻多糖藥物提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 螺旋藻

食用螺旋藻粉購自山東東營康瑞科技開發(fā)有限責任公司，符合國家標準GB/T 16919-1997。

1.2 細胞株

H22肝癌細胞購自上海研晶試劑公司。

1.3 實驗動物

BALB/c小鼠，6～8 周，體重 20 g～22 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。

1.4 儀器

R-1001-L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城儀器有限公司；BCM-1000A型生物潔凈工作臺：南京庚辰科學儀器公司；Forma 3110系列水套CO2培養(yǎng)箱：上海創(chuàng)迅醫(yī)療器械有限公司；XSZ-H型生物顯微鏡：重慶光電儀器有限公司；MK3全自動酶標儀：北京華運安特科技有限公司等。

1.5 螺旋藻多糖提取

螺旋藻粉→配成12%的藻粉溶液→加入胰蛋白酶水解→加入木瓜蛋白酶水解→真空濃縮→酒精沉淀→丙酮洗滌→冷凍干燥→多糖粗制品→柱層析→透析→得多糖精品。

1.6 模型制備及分組

動物適應性飼養(yǎng)7 d后，取健康的小鼠60只（雌雄各半），稱重后隨機分為3組：空白對照組、模型組、給藥組。取接種7d的種鼠腹水H22細胞，用生理鹽水制成細胞數(shù)為2×106個/mL的細胞懸液，以每鼠0.2 mL接種于模型組和給藥組小鼠右前肢腋窩皮下[4]。接種24 h后開始給藥，給藥組以 1000 mg/kg/d灌胃，空白對照組、模型組用等量生理鹽水灌胃，連續(xù)14 d，觀察多糖的抑瘤作用

1.7 螺旋藻多糖抗H22腫瘤作用

1.7.1 臟器指數(shù)和抑瘤率的測定

連續(xù)給藥14 d后，摘取瘤塊、胸腺、脾，按所列公式方法計算抑瘤率、胸腺指數(shù)。

抑瘤率（%）=[1-平均給藥組瘤重（g）/平均模型組瘤重（g）]×100%

胸腺指數(shù)=胸腺重（mg）/體重（g）

脾指數(shù)=脾重（mg）/體重（g）

1.7.2 脾細胞增殖能力的測定

制備濃度為5×106個/mL的脾細胞懸液加入96孔板中，每孔100 μL。實驗孔分兩組分別加ConA（終濃度 10 μg/mL）和 LPS（終濃度 5 μg/mL），對照孔加培養(yǎng)液100 μL，均設3個復孔，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后，離心棄去上清，每孔加入100 μL MTT（終濃度5μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清。每孔加DMSO 150 μL，溶解Fomazan顆粒，充分震蕩后靜置20 min，酶標儀570 nm波長下讀數(shù)，按下列公式計算出其刺激指數(shù)（SI）。

刺激指數(shù)=實驗孔OD570-630值/對照孔OD570-630值

1.7.3 NK細胞殺傷能力的測定

制得脾細胞懸液1×107個/mL作為效應細胞，取對數(shù)期H22肝癌細胞制成5×105個/mL為靶細胞，各組均設六個復孔，效應孔每孔加效應細胞100 μL，培養(yǎng)液100 μL，效靶孔每孔加效應細胞100LμL，靶細胞100 μL，單設一組靶細胞孔，每孔加靶細胞 100 μL，37℃培養(yǎng)4 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO，用酶標儀在570 nm處測定其吸光度值，求出各組平均值以殺傷百分率表示NK細胞活性。

NK細胞活性（%）=[1-（實驗孔OD值-效應孔OD值）/靶細胞對照孔OD值]×100%

1.7.4 吞噬細胞吞噬中性紅能力測定

制備濃度為1.8×106個/mL的腹腔細胞懸液，96孔板中各加100 μL，每組6個復孔，于37℃培養(yǎng)2 h～5 h，棄上清，每孔加入0.073%的中性紅溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄去中性紅，用預冷的PBS洗2次，每孔加入100 μL細胞裂解劑（ 1000 mmol/L醋酸∶無水乙醇=1∶1，體積比），混勻在酶標儀上540 nm處測吸光度值。

1.7.5 小鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）和γ干擾素（IFN-γ）含量的測定

連續(xù)給藥14 d后，空白對照組、模型組、給藥組分別小鼠眼球取血，靜置30 min，2500 r/min離心10 min以分離血清，-20℃保存。ELISA法檢測血清中TNF-α、IFN-γ含量。

1.8 統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)用x±s表示，統(tǒng)計學分析采用雙樣本等方差假設的t檢驗法，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果

小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果見表1。

表1 臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果（±s，n=20）Table 1 The experimental results of organ index and antitumor rate（±s，n=20）

表1 臟器指數(shù)及抑瘤率的測定結(jié)果（±s，n=20）Table 1 The experimental results of organ index and antitumor rate（±s，n=20）

注：△P＜0.05，△△P＜0.01vs空白組；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型組。

分組 脾指數(shù) 胸腺指數(shù) 腫瘤/g 抑瘤率/%空白組模型組給藥組5.32±0. 114.53±0.09△5.09±0.12*2.87±0. 071.59±0.11△△2.49±0.15**—2.65±0. 210.63±0.12**— 074.53%

由表1可見，與空白組相比，模型組脾指數(shù)有明顯差異（P＜0.05），胸腺指數(shù)有明顯差異（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組脾指數(shù)有明顯差異（P＜0.05），給藥組胸腺指數(shù)有明顯差異（P＜0.01）。這就說明螺旋藻多糖對小鼠免疫器官起到了一定的保護作用。與模型組相比，給藥組瘤重顯著降低，差異顯著（**P＜0.01），且抑瘤率達74.53%，而根據(jù)國家藥監(jiān)局新藥特藥評審規(guī)定，抑瘤率達30%以上，就算作有效即可作為新藥開發(fā)。綜上，螺旋藻多糖在一定程度上能夠明顯抑制腫瘤生長。

2.2 小鼠脾淋巴細胞增殖的測定結(jié)果

小鼠脾淋巴細胞增殖的測定結(jié)果見表2。

表2 淋巴細胞增殖實驗結(jié)果（±s，n=20）Table 2 The experimental results of Lymphocyte proliferation（±s，n=20）

表2 淋巴細胞增殖實驗結(jié)果（±s，n=20）Table 2 The experimental results of Lymphocyte proliferation（±s，n=20）

注：**P＜0.01vs模型組。

分組 T細胞刺激指數(shù) B細胞刺激指數(shù)空白組模型組給藥組4.39±0. 232.27±0. 133.74±0.31**4.27±0. 362.11±0. 143.58±0.29**

從表2中得出，與模型組相比，T淋巴細胞的刺激指數(shù)有顯著升高 （P＜0.01），B淋巴細胞的刺激指數(shù)亦有顯著升高（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明小鼠的T細胞和B細胞的刺激指數(shù)均有明顯改善，螺旋藻多糖是一種免疫細胞激活劑，有提高免疫力的作用。

2.3 小鼠脾NK細胞活性的測定結(jié)果

小鼠脾NK細胞活性的測定結(jié)果見表3。

表 3 NK 細胞殺傷活性（±s，n=20）Table 3 Kill rate of NK cells（±s，n=20）

表 3 NK 細胞殺傷活性（±s，n=20）Table 3 Kill rate of NK cells（±s，n=20）

注：△P＜0.05，△△P＜0.01vs空白組；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型組。

分組 NK細胞殺傷率/%空白組模型組給藥組56.19±2. 1333.27±3. 2750.53±4.04**

從表3中得出，與模型組相比顯著性差異（P＜0.01），給藥組小鼠的NK細胞殺傷率達到50.53%，說明給藥組小鼠NK細胞殺傷活性得到有效恢復。與空白組相比，給藥組小鼠NK細胞殺傷率無顯著性差異（P＞0.05）。本實驗結(jié)果表明，螺旋藻多糖可能具有激活NK細胞的活性及抑制NK細胞凋亡的能力。

2.4 巨噬細胞吞噬中性紅能力的測定結(jié)果

巨噬細胞吞噬中性紅能力的測定結(jié)果見表4。

表4 巨噬細胞吞噬中性紅能力（±s，n=20）Table 4 Phagocytic index of Neutral Red（±s，n=20）

表4 巨噬細胞吞噬中性紅能力（±s，n=20）Table 4 Phagocytic index of Neutral Red（±s，n=20）

注：△△P＜0.01vs空白組；**P＜0.01vs模型組。

分組 OD空白組模型組給藥組0.59±0. 030.25±0.01△△0.47±0.03**

從表4中得出，與空白組相比，模型組的吞噬能力明顯下降，呈顯著性差異（P＜0.01）。而給藥組小鼠巨噬細胞的活性卻得到恢復，與空白組相比無顯著性差異（P＞0.05），與模型組相比呈顯著性差異（P＜0.01）。這說明螺旋藻多糖能夠有效改善巨噬細胞的活性，從而提高由巨噬細胞誘導的細胞免疫能力。

2.5 小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量的測定結(jié)果

小鼠血清TNF-α和IFN-γ含量的測定結(jié)果見表5。

表5 小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量（±s，n=20）Table 5 The concentrations of TNF-α and IFN-γ in mice blood serum（±s，n=20）

表5 小鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量（±s，n=20）Table 5 The concentrations of TNF-α and IFN-γ in mice blood serum（±s，n=20）

注：△P＜0.05，△△P＜0.01vs空白組；*P＜0.05，**P＜0.01vs模型組。

分組TNF-α/（pg/mL）IFN-γ/（pg/mL）空白組 30.23±1. 7645.52±2.85模型組 21.19±1.33△△ 30.98±2.37△△給藥組 36.19±2.04* 53.52±3.76*

從表5看出，與空白組相比，模型組血清中TNF-α、IFN-γ 含量均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組血清中TNF-α、IFN-γ含量均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。這說明螺旋藻多糖在一定程度上能夠升高TNF-α、IFN-γ在血清中的濃度，從而發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

3 結(jié)論與討論

科學研究表明藻類中所含有的天然活性植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗腫瘤、毒副作用小的優(yōu)勢，且藥物質(zhì)量通過化學手段容易控制，故藻類多糖藥物的開發(fā)及利用變得越來越重要。

本實驗以 1000 mg/kg/d螺旋藻多糖給小鼠灌胃，抑瘤率可達到74.53%，抑制腫瘤效果良好，這充分說明螺旋藻多糖在抗H22腫瘤方面起到了重要作用。

胸腺和脾臟是機體內(nèi)重要的免疫器官，其中胸腺是是T細胞發(fā)育、分化和成熟的場所，在機體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用；而脾臟是各類免疫細胞居住和產(chǎn)生免疫應答的場所，也是合成免疫活性物質(zhì)（如干擾素、補體、細胞因子等）的重要場所。因此，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)能夠反映機體免疫功能的強弱，可作為評價機體的免疫狀態(tài)的客觀指標。實驗結(jié)果表明，模型組小鼠的胸腺細胞、脾細胞受到腫瘤細胞的誘導而逐漸凋亡，導致胸腺、脾明顯萎縮。螺旋藻多糖能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)與脾指數(shù)，與模型組相比，脾指數(shù)升高呈顯著性差異（P＜0.05），胸腺指數(shù)升高也呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.01），這說明螺旋藻多糖對免疫系統(tǒng)起到了保護和促進恢復作用。

NK細胞的免疫反應在宿主抗腫瘤和抗感染防御機制中扮演著重要角色。NK細胞是細胞免疫的非特異性成分，不需預先活化即可直接殺傷腫瘤細胞，是一類在腫瘤發(fā)生的免疫反應中起重要作用的效應細胞，處于機體抗腫瘤的第一道防線。它的活性受免疫因子調(diào)節(jié)，可引起一系列免疫應答[6，7]。因此，NK細胞殺傷活性的高低也是判斷機體免疫功能尤其是細胞免疫功能大小的重要指標。實驗結(jié)果顯示，螺旋藻多糖能顯著提高NK細胞的殺傷活性，與模型組相比，給藥組的NK細胞殺傷活性提高并呈顯著性差異（P＜0.01）。另外，巨噬細胞是機體抗腫瘤免疫中的重要效應細胞，其抗腫瘤作用的最大特點是對腫瘤細胞的殺傷沒有選擇性，因而巨噬細胞的吞噬能力是衡量機體非特異性免疫功能的標志之一。本實驗結(jié)果表明，與模型組相比，給藥組小鼠巨噬細胞吞噬能力顯著提高（P＜0.01）。以上說明螺旋藻多糖可增強特異性細胞免疫功能，能促進H22荷瘤小鼠非特異性免疫功能。

TNF-α是由活化的巨噬細胞/單核細胞和NK細胞、成纖維細胞產(chǎn)生的細胞因子有介導炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物學功能。TNF-α對腫瘤細胞具有直接的殺傷和誘導凋亡作用[5-9]。TNF-α抗腫瘤具有高選擇性殺傷功能，僅僅對腫瘤細胞細胞毒性作用，而不損傷正常細胞。IFN-γ主要由活化的T細胞和自然殺傷細胞（natural killer cel）所分泌，并以多種方式參與影響免疫應答，是體內(nèi)作用最強的炎癥介質(zhì)之一，其生物學作用非常廣泛，能通過多種機制激發(fā)炎癥反應，在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。IFN-γ抑制腫瘤細胞增殖機制主要有以下幾方面[10-12]：（1）能有效抗腫瘤內(nèi)血管生成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；（2）對惡性腫瘤細胞有直接殺傷作用；（3）干擾素能抑制腫瘤細胞增生，誘導腫瘤細胞凋亡；（4）能夠?qū)Π┗蜻M行調(diào)控，從而抑制癌基因的表達；（5）通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶的表達而發(fā)揮抗腫瘤活性。本實驗結(jié)果顯示，螺旋藻多糖給藥組顯著提高了血清中TNF-α和IFN-γ的含量，增強了機體抗腫瘤的能力，且與模型組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

綜上所述，螺旋藻多糖具有良好的免疫增強活性，對H22腫瘤有抑制作用，提高了H22荷瘤小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)、NK細胞殺傷活性及巨噬細胞的吞噬能力，增加了血清中TNF-α和IFN-γ的含量。從而顯著提高機體免疫力，起到抑制腫瘤細胞的生長的作用。

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