栝樓各藥用部位蛋白質(zhì)含量的比較分析

劉金娜，劉銘，楊太新，賈東升，溫春秀，謝曉亮，*，田偉，劉玲娣

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河北保定071000；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北石家莊050051）

栝樓系葫蘆科（Cucurbitaceae）植物，其入藥部位較多，《中國藥典》已將栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.和雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的種子、果實、果皮及根分別藥用，習(xí)稱瓜蔞子、全瓜蔞、瓜蔞皮及天花粉[1]。栝樓富含油脂類、甾醇類、三萜類、黃酮苷類及蛋白質(zhì)等多種化學(xué)成分，具有改善心血管系統(tǒng)功能、祛痰止咳、抗菌、抗?jié)?、抗腫瘤及瀉下等生物活性[2]。藥理實驗又表明發(fā)揮化痰止咳作用的物質(zhì)與其所含的半胱氨酸、天門冬氨酸和蛋氨酸有關(guān)，蛋白質(zhì)作為生命活動的體現(xiàn)者，轉(zhuǎn)化成小分子氨基酸才能被動植物所利用，因而蛋白的含量在一定程度上可反映氨基酸來源的多少。因此有必要對栝樓各藥用部位的蛋白含量進(jìn)行測定分析。

近年來栝樓的研究多側(cè)重在各入藥部位具體化學(xué)成分的比較分析上，瓜蔞子中3，29-二苯甲?；闃侨嗜?、α-菠菜甾醇含量的比較分析及瓜蔞籽油脂特性的分析[3-5]；瓜蔞皮中揮發(fā)性成分、有機(jī)酸的測定及葉黃素提取工藝的研究[6]；天花粉中葫蘆素B的提取及含量測定等方面多見報道[7]，有關(guān)粗蛋白在栝樓各藥用部位的分布情況及不同種之間的含量比較上報道甚少。

本試驗將搜集到的13個不同居群的栝樓資源集中種植統(tǒng)一管理，除了環(huán)境因子的影響，在同一水平上分別對不同居群的瓜蔞子、瓜蔞皮及天花粉中蛋白的含量進(jìn)行了測定，探明了粗蛋白在栝樓各藥用部位的分布情況，明確了以粗蛋白為評價標(biāo)準(zhǔn)的最優(yōu)栝樓種質(zhì)，為合理開發(fā)利用栝樓資源及品種選育提供參考。

1 材料

1.1 試劑

硫酸銨；Brij- 3530%溶液；硫酸鉀；氫氧化鈉；磷酸氫二鈉；次氯酸鈉；硝普鈉；酒石酸鉀鈉；水楊酸鈉；蒸餾水。

1.2 儀器與材料

AA3型流動分析儀：荷蘭SKALAR公司；AX504分析天平：瑞士梅特勒公司；TDL80-2B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

本實驗所用瓜蔞子、瓜蔞皮及天花粉均由河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。

2 方法

2.1 蛋白質(zhì)含量的測定方法

2.1.1 溶液的制備

緩沖液的配置：取磷酸氫二鈉35.8 g、氫氧化鈉32 g和酒石酸鉀鈉50 g精密稱定，分別加入重蒸水溶解，后稀釋定容至 1000 mL。混合均勻后再加入2 mL Brij- 3530%溶液。

水楊酸鈉溶液的配制：取水楊酸鈉40 g，精密稱定，溶于600 mL蒸餾水中，加入1 g硝普鈉，稀釋定容止至 1000 mL。溶液混均備用。

次氯酸鈉溶液的配制：加入3 mL次氯酸鈉溶液至60 mL水中。再稀釋至100 mL，混合均勻備用。

進(jìn)樣器清洗液的配制：加入40 mL硫酸至600 mL水中，待冷卻后稀釋定容至 1000 mL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取4.717 g硫酸銨精密稱定，加蒸餾水溶解稀釋至1L制成標(biāo)準(zhǔn)液A備用，量取上述標(biāo)準(zhǔn)液A5mL，加蒸餾水稀釋至100mL，配置成每升含氮50mg的標(biāo)準(zhǔn)液B。

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液 B 0、5、7.5、10、12.5、15、20、30 mL，分別置于50 mL容量瓶中，660 nm下采用流動分析儀進(jìn)行分析測定。以峰高A為縱坐標(biāo)，氨氮的濃度c為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得線性方程為：A=0. 9897c+0. 0672，R2=0. 9986，結(jié)果表明氨氮濃度在0～30 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 供試品溶液的制備

取藥材粉末（過40目篩子）約0.2 g，精密稱定，置于消煮管中，向其中加入8 mL的濃硫酸，320℃下消煮至溶液變?yōu)槌吻?，其間每隔30 min加入適量雙氧水。待消煮液冷卻至室溫時，向其中依次加入適量的蒸餾水，搖勻靜置，冷卻后過濾，再加水稀釋至50 mL容量瓶內(nèi)，備用。

2.3 蛋白含量的測定

采用濃硫酸-雙氧水消煮法，將植物體內(nèi)各種形態(tài)的氮轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮進(jìn)入無機(jī)相，硝普鈉用做催化劑，與水楊酸鈉及次氯酸鈉發(fā)生反應(yīng)生成一種藍(lán)色化合物，可在660 nm處測定。

精密量取上述供試品溶液0.5 mL，加水稀釋10倍，采用流動分析法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法，660 nm下比色分析，測得吸光值A(chǔ)，根據(jù)2.1.2項下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備計算其蛋白含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0，組間比較采用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 不同居群栝樓間各藥用部位蛋白的含量

不同居群栝樓間各藥用部位蛋白的含量，見表1。

表1可見，不同種質(zhì)栝樓間各藥用部位蛋白含量具有一定的差異性，籽中蛋白含量最高的種質(zhì)來源于河南安陽文峰區(qū)，其含量最高可達(dá)（69.758±0. 0327）mg/g，果皮中蛋白含量最高屬山西侯馬為（93.443±0. 0398）mg/g，根中蛋白含量最高達(dá)（51.076±0. 0550）mg/g來自于河北安國。

表1 不同居群栝樓各藥用部位蛋白含量（mg/g，n=3）Table 1 Medicinal parts of protein content in different group of Trichosanthes kirilowii

3.2 不同地域栝樓間各藥用部位蛋白含量的比較分析

不同地域栝樓間各藥用部位蛋白含量的比較分析，見表2。

表2 不同地域栝樓間各藥用部位蛋白含量比較分析（mg/g，n=3）Table 2 Medicinal parts of protein content in different area of Trichosanthes kirilowii

將同一省份內(nèi)的不同栝樓居群各入藥部位的蛋白含量進(jìn)行合并，由表2知，不同省份栝樓中蛋白含量差異顯著，其中山西、河南地區(qū)蛋白含量差異不明顯，但與其他3省差異達(dá)顯著水平，安徽地區(qū)蛋白含量最低；瓜蔞子、瓜蔞皮及天花粉不同地域之間蛋白含量亦差異顯著，其中河南地區(qū)瓜蔞子中蛋白的含量最高且顯著高于其他四省，山東、河北、山西地區(qū)瓜蔞子中蛋白的含量差異不明顯；山西地區(qū)瓜蔞皮中蛋白含量最高，其次為河南、山東、河北，安徽地區(qū)蛋白含量最低；河北地區(qū)天花粉中蛋白達(dá)到最大值，顯著高于山東、安徽、山西、河南四省。

3.3 各藥用部位蛋白含量的比較分析

栝樓各藥用部位蛋白含量均差異顯著，其中來自河北、山東、安徽的栝樓資源，其種子中蛋白含量顯著高于皮和根；山西、河南的栝樓種質(zhì)，其皮部蛋白最高，其次為子，根部最低，見圖1。

圖1 栝樓各藥用部位蛋白含量的比較Fig.1 Comparation of protein content in different medicinal parts of Trichosanthes kirilowii

4 結(jié)論與討論

連續(xù)流動分析儀是近年來發(fā)展起來的一種分析技術(shù)，可將繁瑣的手工比色付諸于自動的儀器操作，并能使所有的樣品在同等的條件下發(fā)生反應(yīng)，再通過檢測器將信號傳入電腦進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，同時減小了手工操作和條件差異產(chǎn)生的誤差，具有靈敏、快速高效、省時省力省試劑、污染小等優(yōu)點已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)藥、化工分析等領(lǐng)域。本試驗采用了該方法對河北、山東、安徽、河南、山西5省共13份栝樓資源各藥用部位中的蛋白含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明不同藥用部位蛋白含量差異顯著，不同地域之間其蛋白含量亦差異顯著，其中河南安陽一帶的栝樓種質(zhì)其種子中蛋白含量最高為（69.758±0. 0327）mg/g，以蛋白含量為考評指標(biāo)，供藥食兩用具有較高的營養(yǎng)價值，山西侯馬一帶的瓜蔞皮中的蛋白含量最高為（93.443±0. 0398）mg/g，河北安國一帶的天花粉中蛋白含量最高為（51.076±0. 0550）mg/g，因此根據(jù)市場需求及收獲目的的不同，可選擇最優(yōu)的種質(zhì)資源田間栽培以期獲得較高的經(jīng)濟(jì)效益。

整體分析可知，山西、河南一帶的栝樓資源引種于河北石家莊，其總蛋白含量較安徽高，山東居中，這可能與南北氣候差異較大有關(guān)，一般相同緯度下引種較容易，然而山西侯馬、絳縣、新絳以及河南安陽，其緯度與石家莊最為接近，受環(huán)境影響較小，加之河南安陽一帶是全國栝樓的主產(chǎn)區(qū)之一，栝樓種質(zhì)較優(yōu)，其含量相對較高，安徽隸屬南方，南北氣候差異較大，引種不易，其蛋白含量較低在很大程度上與不適應(yīng)的氣候有關(guān)。

本實驗的材料均播種在同一生長環(huán)境下，同樣的栽培條件其蛋白含量亦差異顯著，多年種植后，這種差異會趨于一致但仍存在一定的差異性。環(huán)境在一定程度上會影響植物體內(nèi)物質(zhì)組成的改變，但不能起到?jīng)Q定性的作用，基因型的改變才會引起質(zhì)的變化。優(yōu)質(zhì)的中藥材不僅產(chǎn)量要高，其能發(fā)揮藥效的物質(zhì)的含量也應(yīng)該較高。然而通過轉(zhuǎn)基因的方法獲得的中藥種質(zhì)，雖然產(chǎn)量增加了但是發(fā)揮藥效的物質(zhì)的含量并沒有增加，可能還有減少的趨勢，甚者還會產(chǎn)生未知的新物質(zhì)，影響藥材的配伍及藥效的發(fā)揮，具有一定的風(fēng)險性，因此藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)的選育宜從栽培條件的優(yōu)化和常規(guī)育種方法著手。優(yōu)質(zhì)的藥材種質(zhì)種植在不適宜生長的環(huán)境下，其發(fā)揮藥效成分的物質(zhì)會慢慢減少，甚者長時間種植會不及普通的種質(zhì)資源，而普通的種質(zhì)種植在最適宜的環(huán)境下，其藥效含量會有上升的趨勢，然而優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)在其最適宜的環(huán)境下生長所收獲的藥材，其質(zhì)優(yōu)，穩(wěn)定，療效可靠，可以稱之為道地藥材。因此對中藥材道地性的研究宜為中藥材優(yōu)質(zhì)種質(zhì)選育的手段之一，必要時結(jié)合常規(guī)雜交育種方式，以期為中藥優(yōu)質(zhì)種質(zhì)選育提供新思路。

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