藥用植物琉璃苣根尖壓片技術(shù)研究

周慧媛 張紅梅 李思穎 蔡寶宏 楊文平

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北唐山 063000;①唐山市第一中學(xué))

琉璃苣(Borago officinalis L.)是紫草科一年生草本植物，原產(chǎn)于小亞細(xì)亞和地中海沿岸。該植物稍具黃瓜香味，全身披滿白色絨毛，葉大，綠色橢圓形，葉緣有細(xì)齒，花藍(lán)色或藍(lán)紫色。果為小堅(jiān)果，長(zhǎng)5mm，具棱。此外，琉璃苣是歐洲人使用了700年的藥草，擁有許多醫(yī)學(xué)價(jià)值。植物染色體的研究對(duì)物種的變異、進(jìn)化、遺傳以及生活力過程平衡的控制都具有重要的作用。目前尚未有琉璃苣根尖壓片技術(shù)、染色體數(shù)目、核型分析等細(xì)胞水平的相關(guān)報(bào)道。本研究以琉璃苣根尖為材料，探討根尖壓片法制備琉璃苣染色體的最佳條件，為琉璃苣細(xì)胞學(xué)特征、遺傳機(jī)制、染色體核型分析的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 琉璃苣種子購(gòu)于興華專業(yè)花卉種子公司，經(jīng)學(xué)院教研室的李超老師鑒定。

1.2 方法

1.2.1 取材。大解剖盤中平鋪1cm左右的松針土，其上再撒上一層琉璃苣種子，而后種子上覆蓋一薄層松針土。定時(shí)澆水，保持濕度，室溫下培養(yǎng)萌發(fā)。培養(yǎng)1周后，選取長(zhǎng)約1cm左右的根尖，取材時(shí)一般取包括根毛區(qū)在內(nèi)的整個(gè)根尖。從上午8:00～16:00每隔半小時(shí)剪取根尖1次，每次約剪根尖20個(gè)左右。

1.2.2 預(yù)處理。剪好的根尖分別于0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%秋水仙素中預(yù)處理。每種濃度分1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h幾個(gè)時(shí)間段，以其確定預(yù)處理的最佳條件。

1.2.3 固定。經(jīng)預(yù)處理后的材料用蒸餾水沖洗干凈，放入卡諾固定液(3甲醇:1冰醋酸)中固定2～4h。

1.2.4 解離。解離液為0.1mol/L的HCl。用蒸餾水將固定后的材料沖洗干凈，放入解離液中解離。分別在室溫和60℃下將材料分 5、8、10、12、15、17、20min7 個(gè)時(shí)間段解離，最后根據(jù)觀察結(jié)果確定最佳解離條件。

1.2.5 低滲。解離后的細(xì)胞放入蒸餾水中停留5min以上，一般不超過2h，使細(xì)胞充分吸水膨脹，便于染色體分散。

1.2.6 染色和壓片。配制改良石炭酸品紅染色液［1］，放置2周后使用。經(jīng)低滲的材料放置于載玻片上，用手術(shù)刀切取每個(gè)根尖呈乳白色的分生區(qū)部分(此區(qū)較膨大)1mm左右，在根尖材料上滴一滴染色液進(jìn)行染色，10min即可。染色后的材料按常規(guī)方法壓片，制成臨時(shí)裝片。

1.2.7 鏡檢和封片。顯微鏡下選擇分散好的染色體中期分裂相計(jì)數(shù)。在有良好分散相的裝片上滴1滴二甲苯，用手術(shù)刀片將蓋玻片揭開，使有細(xì)胞的一面向上置于載玻片空白處，在37℃烘箱中烘24h以上，用加拿大樹膠封片，選取分散良好的中期細(xì)胞進(jìn)行顯微攝影。

2 結(jié)果與分析

2.1 取材時(shí)間 通過分不同的時(shí)間段取材，觀察不同取材時(shí)間對(duì)染色體壓片技術(shù)的影響。根據(jù)視野中所觀察到的中期細(xì)胞的多少，來確定最佳的取材時(shí)間。最佳取材時(shí)間為上午8:00～9:00，此時(shí)處于中期的琉璃苣細(xì)胞較多，見圖1、圖2。

圖1 處于分裂中期的琉璃苣細(xì)胞圖

圖2 琉璃苣體細(xì)胞分裂中期染色體圖

2.2 秋水仙素濃度和處理時(shí)間 秋水仙素預(yù)處理是制備染色體成功的關(guān)鍵步驟，實(shí)驗(yàn)中最終確定預(yù)處理的最佳條件為0.1%秋水仙素預(yù)處理2.5～3h。不同濃度的秋水仙素和不同的處理時(shí)間，對(duì)染色體制備有一定的影響。秋水仙素濃度過大、處理時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致染色體凝集成顆粒狀或團(tuán)塊狀，無(wú)法進(jìn)行染色體類型鑒定。反之，秋水仙素濃度過低或處理時(shí)間過短，獲得的中期細(xì)胞較少。因此，在制備植物染色體壓片時(shí)，一定要根據(jù)不同的植物材料，選擇合適的預(yù)處理液濃度和預(yù)處理時(shí)間，以其制備更佳的染色體標(biāo)本。

2.3 解離時(shí)間 不同的解離時(shí)間，影響細(xì)胞膜的破裂情況。解離時(shí)間過長(zhǎng)，容易造成染色體丟失;解離時(shí)間過短，細(xì)胞壁不易破碎，細(xì)胞呈方形，沒有膨脹，無(wú)法得到分散的染色體。結(jié)果表明0.1mol/L HCl 60℃水浴5min，效果較好。

總之，影響根尖壓片技術(shù)的因素很多，植物材料的生理狀態(tài)、預(yù)處理液的濃度、處理時(shí)間、解離條件、染色條件等。實(shí)驗(yàn)中以1cm左右的琉璃苣根尖為試材，上午8:00～9:00剪取，經(jīng)0.1%的秋水仙素預(yù)處理2.5～3 h，0.1mol/L HCl 60℃水浴解離5min，改良石炭酸品紅溶液染色10min，對(duì)琉璃苣根尖進(jìn)行常規(guī)染色體壓片，即可制備出分散良好的琉璃苣染色體標(biāo)本(圖2)，為琉璃苣的細(xì)胞學(xué)特征、遺傳機(jī)制、染色體核型分析的研究提供理論依據(jù)。經(jīng)過對(duì)30個(gè)染色體分散較好的中期細(xì)胞的分析，初步確定琉璃苣細(xì)胞的染色體數(shù)目為2n=18。

預(yù)處理可以積累大量處于分裂中期的染色體，還可以誘導(dǎo)染色體進(jìn)一步凝集，便于染色體分散。不經(jīng)預(yù)處理的材料，由于分裂指數(shù)偏低，不適宜進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。但要確定最佳的預(yù)處理時(shí)間以及預(yù)處理液濃度。一般的材料選用秋水仙素進(jìn)行預(yù)處理即可。

［1］楊大翔.遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.157?