多肋藻渣中褐藻膠提取工藝及其分離純化研究

李麗迪，王 迪，汪秋寬，侯 麗，何云海，宋悅凡，叢海花

(大連海洋大學(xué)國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧大連116023)

多肋藻(Costaria costata)屬于褐藻門、褐子綱、海帶目、海帶科、多肋藻屬，在亞洲主要分布于日本及朝鮮半島海域，是我國近年新栽培的褐藻［1］。多肋藻富含褐藻膠及多種人體必需的微量元素［2］，可食用，同時(shí)也是海藻工業(yè)的重要原料［3］。因多肋藻富含褐藻多糖硫酸酯，近些年對其的研究很多［4-5］，研究工作主要集中在多肋藻褐藻多糖硫酸酯與褐藻膠。多肋藻加工過程中會(huì)產(chǎn)生一些廢棄藻渣，含有數(shù)量可觀的褐藻膠，未見對多肋藻渣中有效成分的提取及分析相關(guān)研究與報(bào)道。因此本研究擬通過實(shí)驗(yàn)研究多肋藻渣中褐藻膠的最佳提取工藝，以期為多肋藻的高效綜合利用奠定基礎(chǔ)，為實(shí)際的加工生產(chǎn)節(jié)約成本［6］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多肋藻渣 多肋藻提取褐藻多糖硫酸酯［7］后剩余的物質(zhì)，冷凍保存?zhèn)溆?褐藻膠標(biāo)準(zhǔn)品 食品級，青島明月海藻集團(tuán)有限公司提供;濃硫酸 國產(chǎn)優(yōu)級純;95%乙醇 食用乙醇;其他試劑均 國產(chǎn)分析純。

Sartorius普及型pH計(jì)(PB-10) 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;LD5-2A型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;ALPHAI-5型真空冷凍干燥機(jī) 德國制造;BS2000S型分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;722S型分光光度計(jì) 上海分析儀器總廠;SBS-160型數(shù)控計(jì)滴自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠;CL-1A型磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SZ-93型自動(dòng)雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器廠;BT100-2J型恒流泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝流程 稱取一定量多肋藻渣，加入一定濃度的碳酸鈉溶液浸泡，恒溫水浴加熱一定時(shí)間，離心(4500r/min，15min)取上清液，加入95%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的食用乙醇，至溶液中乙醇含量為30%，離心，將得到的沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得到的粉末即為褐藻膠［8-9］。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)方法 在單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，以褐藻膠粗得率為檢測指標(biāo)，分析各因素對褐藻膠粗得率的影響。考察溫度對褐藻膠粗得率的影響時(shí)，控制體系的碳酸鈉濃度1%、料液比1∶25(g/mL)、提取時(shí)間5h，設(shè)置不同的提取溫度(50、60、70、80、90℃)。考察時(shí)間對褐藻膠粗得率的影響時(shí)，控制體系的提取溫度70℃，碳酸鈉濃度1%，料液比1∶25(g/mL)，設(shè)置不同的提取時(shí)間(2、3、4、5、6h)。考察料液比對褐藻膠粗得率的影響時(shí)，控制體系的提取溫度70℃，碳酸鈉濃度1%，提取時(shí)間5h，設(shè)置不同的料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45)。考察料液比對褐藻膠粗得率的影響時(shí)，控制體系的提取溫度70℃，料液比 1∶40(g/mL)，提取時(shí)間 5h，設(shè)置不同的碳酸鈉濃度(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多肋藻渣中褐藻膠的粗得率和純度為指標(biāo)，采用4因素3水平正交設(shè)計(jì)探討多肋藻渣中褐藻膠的最佳提取工藝，正交因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 得率和純度的計(jì)算 粗得率(%)=粗褐藻膠質(zhì)量/多肋藻渣質(zhì)量×100

純度(%)=咔唑硫酸法測定出的褐藻膠質(zhì)量(g)/粗褐藻膠質(zhì)量(g)×100

得率=粗得率×純度

提取物中褐藻膠含量的測定采用咔唑硫酸法［10］。冰水浴中向9mL 80%濃硫酸中加入0.4mL 0.1%的褐藻膠溶液，加水補(bǔ)至10mL，沸水浴30min后冷卻5min，加入0.3mL咔唑溶液，繼續(xù)沸水浴10min，冷卻后在530nm處測定吸光值;依褐藻膠標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=1.650x(R2=0.999)計(jì)算褐藻膠含量。

1.2.5 分離純化方法

1.2.5.1 D301-T弱堿性陰離子樹脂交換層析 采用D301-T弱堿性陰離子樹脂交換層析柱(φ2.6×30cm)純化。稱取一定量的褐藻膠溶解，先用0.2mol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫，再經(jīng)0～2mol/L NaCl線性梯度洗脫，流速1mL/min，自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集，每管4mL，咔唑硫酸法跟蹤測定其褐藻膠含量，直到收集管中檢測不出褐藻膠為止。

1.2.5.2 Sephacryl S-300凝膠層析 色譜柱φ1.6×90cm、緩沖液為0.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液、速度為3mL/10min，每管3mL，標(biāo)準(zhǔn)品為藍(lán)色葡聚糖(Blue dextran，type 2000)，葡聚糖(Mr=4.41 × 104Da，6.67×104Da，1.35 ×105Da，Sigma)將 D301-T 純化褐藻膠得到的組分上柱，經(jīng)過Sephacryl S-300凝膠層析，確定每個(gè)組分的相對分子質(zhì)量范圍。

1.2.6 理化性質(zhì) 色澤及性狀、pH、透光率和粘度測定采用GB 1976-2008，食品添加劑 褐藻酸鈉［11］中的測定方法;重金屬含量測定均采用國標(biāo)中［12-13］的測定方法。

測定結(jié)果與GB 1976-2008，食品添加劑褐藻酸鈉相比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 不同提取溫度對褐藻膠粗得率的影響 提取溫度對褐藻膠粗得率的影響見圖1。隨著溫度的上升，褐藻膠的粗得率先增大后減小，當(dāng)溫度達(dá)到70℃，褐藻膠粗得率達(dá)到最高，為15.88%?？紤]到溫度過高時(shí)，可能導(dǎo)致大分子斷裂成小分子，影響得率［14-15］。因此選取 65、70、75℃作正交優(yōu)化以確定最佳提取溫度。

圖1 提取溫度對褐藻膠粗得率的影響Fig.1 Influence of extracting temperature on the yield of sodium alginate

2.1.2 不同提取時(shí)間對褐藻膠粗得率的影響 提取時(shí)間對褐藻膠粗得率的影響見圖2。隨著時(shí)間的增加，褐藻膠的粗得率隨時(shí)間的增加而增加，5h以后，褐藻膠的粗得率有所下降。這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間短，藻體不能完全破壞，反應(yīng)不完全;而當(dāng)提取時(shí)間超過5h，褐藻膠又有所降解，從而導(dǎo)致其得率偏低［16］。因此選取 4.5、5.0、5.5h 作正交優(yōu)化以確定最佳提取時(shí)間。

2.1.3 不同料液比對褐藻膠粗得率的影響 料液比對褐藻膠粗得率的影響見圖3。隨著料液比的增大，褐藻膠的粗得率呈上升趨勢，并趨于平緩。當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，達(dá)到最佳的褐藻膠粗得率20.31%。適當(dāng)?shù)牧弦罕饶苁乖现械暮衷迥z得到充分提取，而且可減少溶劑的浪費(fèi)，節(jié)省提取成本。因此選取1∶35、1∶40、1∶45 作正交優(yōu)化以確定最佳料液比。

圖2 提取時(shí)間對褐藻膠粗得率的影響Fig.2 Influence of extracting time on the yield of sodium alginate

圖3 料液比對褐藻膠粗得率的影響Fig.3 Influence of Solid-Liquid Ratio on the yield of sodium alginate

2.1.4 不同碳酸鈉濃度對褐藻膠粗得率的影響 碳酸鈉濃度對褐藻膠粗得率的影響見圖4。隨著碳酸鈉濃度的升高，褐藻膠的粗得率呈上升趨勢，而后趨于平緩。當(dāng)碳酸鈉濃度為3.5%時(shí)，粗得率最高。碳酸鈉濃度低時(shí)得率低，可能是因?yàn)樵弩w不能完全破壞，反應(yīng)不完全;而且碳酸鈉溶液的濃度過高，會(huì)造成生產(chǎn)成本的提高，降低經(jīng)濟(jì)效益。因此選取3.0%、3.5%、4.0%作正交優(yōu)化以確定最佳碳酸鈉濃度。

圖4 碳酸鈉濃度對褐藻膠粗得率的影響Fig.4 Influence of Na2CO3 concentration on the yield of sodium alginate

2.2 正交提取條件的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以褐藻膠粗提率和純度為指標(biāo)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)見表3。

由表2中可以看出，以粗得率為指標(biāo)的因素影響程度依次為:C、A、D、B，理論最佳組合為A2B3C3D2，而實(shí)驗(yàn)最佳組合為A3B1C3D2;以純度為指標(biāo)的因素影響程度依次為:C、B、D、A，理論最佳組合為A2B3C2D2，而實(shí)驗(yàn)最佳組合為A1B2C2D2。

表2 褐藻膠提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of extraction technology of alginate from Costaria costata residues

表3 褐藻膠提取最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 3 The comparison analysis of the extraction of sodium alginate at the optimum conditions

為確定堿提法提取褐藻膠的最佳工藝參數(shù)，對組合A2B3C3D2和A2B3C2D2進(jìn)件驗(yàn)證。粗得率最高組為A3B1C3D2，但其純度最低;A1B2C2D2的純度和得率均最高，其粗得率最低。在綜合考慮下，選取A1B2C2D2作為實(shí)驗(yàn)的最佳組合。因此，確定了堿提法提取褐藻膠的最佳工藝參數(shù):提取時(shí)間4.5h、料液比1∶40、堿液濃度3.5%、提取溫度70℃，在該條件下水解，多肋藻渣中褐藻膠的粗得率為44.07% ±0.22%，純度為94.77% ±0.19%。在最佳提取工藝條件下進(jìn)行中試生產(chǎn)供后期實(shí)驗(yàn)使用。

2.3 分離純化研究

2.3.1 D301-T弱堿性陰離子樹脂柱層析 D301-T弱堿性陰離子樹脂柱層析洗脫曲線見圖5。由圖5可見，梯度洗脫后共有2個(gè)峰，分別稱為F1、F2，其中F1為未經(jīng)鹽洗脫的流出峰，其回收率分別為19.33%和63.33%;褐藻膠含量分別為84.56%和89.69%。

圖5 D301-T梯度洗脫曲線Fig.5 The grading elution curve of alginate on D301-T column

2.3.2 Sephacryl S-300凝膠層析 通過藍(lán)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Mr＞2.0×106)，以及葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Mr=4.41×104、6.67 ×104、1.35 ×105)，得到外水體積為87mL，相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-2.5417x+5.5216，R2=0.9993。

將組分F1和F2分別經(jīng)過Sephacryl S-300凝膠柱層析，進(jìn)一步分離純化，并測定其相對分子質(zhì)量。洗脫曲線如圖6、圖7所示。

圖6 F1的Sephacryl S-300凝膠柱層析圖譜Fig.6 Chromatogram of F1 with Sephacryl S-300 column

圖7 F2的Sephacryl S-300凝膠柱層析圖譜Fig.7 Chromatogram of F2 with Sephacryl S-300 column

由圖 6和圖 7可以看出，組分 F1，F(xiàn)2經(jīng)Sephacryl S-300凝膠柱層析分別只得到一個(gè)對稱峰，這表明各組分組成均一、純度較高。F1的洗脫峰其相對分子質(zhì)量為257ku;F2的洗脫峰其相對分子質(zhì)量為81ku。

2.4 理化性質(zhì)

檢測褐藻膠粗提物、組分F1和組分F2的理化性質(zhì)，檢驗(yàn)結(jié)果如表4。三者均溶于水，不溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑。根據(jù)GB 1976-2008，食品添加劑褐藻酸鈉中規(guī)定，褐藻膠、組分F1和組分F2的色澤、性狀、pH、透光率和重金屬含量均符合標(biāo)準(zhǔn)，但粘度過低，可能是因?yàn)槎嗬咴逶谔崛『衷宥嗵橇蛩狨サ倪^程中經(jīng)過98℃高溫蒸煮導(dǎo)致褐藻膠的降解，這與盤茂東等［14］的研究結(jié)果相一致。

表4 理化性質(zhì)Table 4 Physical and chemical properties

3 結(jié)論

褐藻膠是海帶、海藻、巨藻等所有褐藻屬中都含有的主要成分［17］。褐藻膠作為一種天然高分子物質(zhì)以其良好的生物降解性和生物相容性，以及良好的增稠性、成膜性、穩(wěn)定性、絮凝性和螯合性［18］而被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域［18-22］。

利用多肋藻提取褐藻多糖硫酸酯后，剩余大量藻渣，既造成資源的浪費(fèi)，又會(huì)對環(huán)境有一定的破壞。本文采用正交實(shí)驗(yàn)方案研究了從多肋藻渣中提取褐藻膠的工藝研究，得出最佳的提取工藝條件是時(shí)間 4.5h、料液比 1∶40、Na2CO3濃度 3.5%、溫度70℃，褐藻膠的粗得率為44.07%，純度為94.77%。這說明用堿提法提取多肋藻渣中褐藻膠是可行的，而且得率和純度均較高。

褐藻膠F經(jīng)D301-T弱堿性陰離子樹脂柱層析和Sephacryl S-300凝膠柱層析得到兩個(gè)單一組分，相對分子質(zhì)量分別為257、81ku，這與其粘度測定結(jié)果相符。重金屬檢測顯示其含量均未超標(biāo)。本文介紹的提取工藝流程簡單易行，成本低，適合于工業(yè)生產(chǎn)，對充分高效利用多肋藻有重要的理論和實(shí)踐意義。

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