交替糖蔗糖酶受體反應(yīng)產(chǎn)低聚四糖及其條件優(yōu)化

許 婷，繆 銘，張 濤，江 波

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

交替糖蔗糖酶(alternansucrase，EC2.4.1.140)最早是由 C?té［1］等發(fā)現(xiàn)，由腸膜明串珠菌 NRRL B-1355在蔗糖的誘導(dǎo)下分泌，該酶可以合成含有交替α-(1→3)，α-(1→6)糖苷鍵的葡聚糖，故 C?té等人根據(jù)此種葡聚糖的結(jié)構(gòu)特征將其命名為交替糖(alternan)，而合成該糖的酶則將其命名為交替糖蔗糖酶。在對(duì)交替糖蔗糖酶進(jìn)行研究時(shí)，C?té等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中存在一些低分子量的受體糖分子時(shí)，交替糖蔗糖酶可以催化其合成含有交替α-(1→3)，α-(1→6)糖苷鍵的低聚糖［2］。

交替糖蔗糖酶的受體反應(yīng)產(chǎn)生的低聚糖產(chǎn)物具有一些優(yōu)良的特性，Maria［3］等人研究了以蔗糖和麥芽糖為底物，由交替糖蔗糖酶催化生產(chǎn)的麥芽糖低聚糖的益生特性，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌的生長(zhǎng)，是一種良好的益生元。此外，除了可以作為益生元，這些低聚糖還可以改善食品的苦味［4］，增加某些糖類、黃酮類的溶解性［5-6］。

本實(shí)驗(yàn)研究了嗜檸檬酸明串珠菌 Leuconostoc citreum SK 24.002所產(chǎn)的交替糖蔗糖酶，在上清及細(xì)胞膜上的分布情況，并研究了反應(yīng)時(shí)間、加酶量、pH、溫度及底物濃度對(duì)該酶受體反應(yīng)產(chǎn)低聚四糖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菌種 嗜檸檬酸明串珠菌Leuconostoc citreum SK 24.002，為實(shí)驗(yàn)室自篩菌種;蔗糖、果糖、麥芽糖、酵母粉、胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、無水氯化鈣、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸錳、硫酸鐵、抗壞血酸、醋酸鈉、冰醋酸、尿素、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、牛白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、溴酚藍(lán)、β-巰基乙醇、甘氨酸等 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;TEMED、過硫酸銨 均為分析純，BBI公司。

Delta 320s型pH計(jì) 美國Metolee-toledo儀器有限公司;Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;Agilent 1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;Optima L-80XP超速離心機(jī) 美國貝克曼公司;DV-2102 PC型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L):蔗糖20、酵母粉7.5、胰蛋白胨7.5、磷酸氫二鉀10、吐溫80 10、無水氯化鈣0.02、混合鹽溶液20mL/L(混合鹽成分:七水硫酸鎂0.05g/L、氯化鈉0.05g/L、一水合硫酸錳0.05g/L、七水合硫酸亞鐵 0.25g/L、抗壞血酸0.25g/L)，pH7.5。菌種接種量為 5%，接種后于30℃、160r/min的條件下培養(yǎng)20h。

1.2.2 酶活的分布 將培養(yǎng)20h后的發(fā)酵液于4℃下離心20min(8000r/min)，分別得到上清和沉淀。所得沉淀用50mmol/L pH5.4的NaAc-HAc緩沖液清洗兩遍。采用50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液溶解沉淀，并對(duì)其進(jìn)行高壓破碎，將所得裂解液于4℃，10000r/min下離心30min，得到上清(S1)和沉淀(P1)。再次用50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液洗滌P1兩遍，之后用同樣的緩沖液溶解。對(duì)S1進(jìn)行超高速離心，即于4℃，35000r/min的條件下離心1h，得到上清(S2)和沉淀(P2)，用 50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液洗滌P2兩遍，之后用相同的緩沖液溶解。測(cè)定各部分:發(fā)酵液、發(fā)酵液上清、發(fā)酵液沉淀、S1、P1、S2、P2的酶活及蛋白含量，具體操作見1.3.1及1.3.2。

1.2.3 細(xì)胞膜上的酶的提取 將發(fā)酵液于4℃下離心 20min(8000r/min)，用 50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液清洗沉淀兩遍，得到濕菌體。據(jù)報(bào)道，利用尿素可以提取細(xì)胞膜上的酶［7］，故采取用8mol/L尿素溶液處理菌體沉淀，具體操作為:將洗滌后的濕菌體充分混勻于8mol/L尿素溶液中，在0℃下處理1h(間接震蕩搖晃)，之后于8000r/min離心15min，取上清，將其于50mmol/L pH5.4 NaAc-HAc緩沖液中充分透析，所得透析后的溶液便為細(xì)胞膜上的酶的粗酶液。測(cè)定其酶活及蛋白含量，具體操作見1.3.1及1.3.2。

1.2.4 受體反應(yīng)產(chǎn)低聚四糖的條件優(yōu)化 以蔗糖為供體、麥芽糖為受體，細(xì)胞膜上的交替糖蔗糖酶為酶液，進(jìn)行受體反應(yīng)產(chǎn)低聚四糖(DP4)。研究不同加酶量、pH、溫度、底物濃度及反應(yīng)時(shí)間對(duì)麥芽四糖產(chǎn)量的影響。

1.2.4.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，反應(yīng)體系為100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖+0.3U/mL的酶液，反應(yīng)在50mmol/L pH5.4的醋酸緩沖體系中進(jìn)行，反應(yīng)溫度為40℃。分別于10、20、30、40、50、60min、2、3、4、5、6h 取樣，測(cè)定其DP4糖含量。各組反應(yīng)重復(fù)三次。

1.2.4.2 加酶量對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，反應(yīng)體系為:100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖+不同加酶量，加酶量分別為:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6U/mL。反應(yīng)在 50mmol/L pH5.4 的醋酸緩沖體系，40℃下進(jìn)行，采取最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)各組DP4糖含量進(jìn)行測(cè)定。各組反應(yīng)重復(fù)三次。

1.2.4.3 反應(yīng)體系pH對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，在最優(yōu)時(shí)間和最適加酶量的條件下，分別用 NaAc-HAc緩沖液和 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液將反應(yīng)體系的pH調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件同上，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定各組DP4糖的含量。各組反應(yīng)重復(fù)三次。

1.2.4.4 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，在最優(yōu)時(shí)間、最適加酶量與最適pH 的條件下，分別于 25、30、40、50、60℃ 下反應(yīng)，其他條件同上，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定各組DP4糖的含量。各組反應(yīng)重復(fù)三次。

1.2.4.5 底物濃度比例對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 以蔗糖和麥芽糖為底物，在最優(yōu)時(shí)間、最適加酶量、最適pH及最適溫度的條件下，改變供體分子蔗糖與受體分子麥芽糖的比例進(jìn)行反應(yīng)，采取的比例(蔗糖∶麥芽糖)為:5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，其中，供體分子蔗糖的濃度為 100g/L，麥芽糖的濃度根據(jù)上述比例進(jìn)行計(jì)算調(diào)整。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定各組酶反應(yīng)產(chǎn)物中的DP4糖的含量。各組反應(yīng)重復(fù)三次。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 酶活測(cè)定方法 反應(yīng)體系為900μL 10%的蔗糖緩沖液+100μL酶液，反應(yīng)前將底物10%的蔗糖緩沖液在40℃下保溫30min，酶液在45℃下熱處理30min［8］。反應(yīng)溫度為 40℃，時(shí)間為 30min。用 DNS方法［9］測(cè)定反應(yīng)液中還原糖含量。酶活定義:在40℃下，每分鐘產(chǎn)生1μmol果糖所需的交替糖蔗糖酶的含量。

1.3.2 蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛白蛋白為標(biāo)樣。具體操作:每1mL樣品加入5mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混勻后靜置5min，在595nm下測(cè)定吸光度。

1.3.3 受體反應(yīng)產(chǎn)物DP4糖含量的測(cè)定 利用高效液相色譜HPLC對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。將受體反應(yīng)的反應(yīng)液煮沸5min以終止反應(yīng)，然后按1∶1比例加入乙醇，混合均勻后于10000r/min下離心30min，取上清，用去離子水稀釋三倍后上樣。HPLC條件:Anglent 1260;色譜柱:APS-2 Hypersil(250mm×4.6mm);流動(dòng)相:75%乙腈;流速:1.0mL/min;檢測(cè)器:示差檢測(cè)器;柱溫:室溫(25℃);進(jìn)樣量:10μL。受體反應(yīng)的產(chǎn)物及DP4糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖見2.2.2中圖2所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活分布

腸膜明串珠菌所產(chǎn)的交替糖蔗糖酶有部分存在于細(xì)胞膜上，而各部位的酶可以通過不同的離心速度進(jìn)行提取分離［10］。將細(xì)胞裂解液在10000r/min下離心30min，所得到的沉淀P1基本為菌體碎片，所得上清S1繼續(xù)在110000×g的條件下離心得到的沉淀P2為細(xì)胞膜上蛋白，而上清S2則為可溶性蛋白。圖1為各部分比酶活大小的比較。

圖1 各部位比酶活的比較Fig.1 Comparison of alternansucrases from different parts

從圖1可以看出，各部位比酶活中，膜蛋白(P2)比酶活最大，可見由該腸膜明串珠所產(chǎn)的交替糖蔗糖酶主要分布在細(xì)胞膜上，而分布于上清中的酶活很低。所以在后續(xù)研究中，以細(xì)胞膜上的酶為研究對(duì)象。

2.2 受體反應(yīng)產(chǎn)DP4糖的條件優(yōu)化

2.2.1 時(shí)間對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 由圖2可見，在反應(yīng)前60min內(nèi)，DP4產(chǎn)量較低，但速度較快;直至180min時(shí)，反應(yīng)速度才有所降低，在此期間，DP4產(chǎn)量大幅增加;當(dāng)時(shí)間達(dá)到300min時(shí)，DP4產(chǎn)量基本維持不變，可見此時(shí)反應(yīng)體系已達(dá)到飽和狀態(tài)。因而，從效率的角度考慮，300min為最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間，此時(shí)體系的反應(yīng)已達(dá)到穩(wěn)定，且時(shí)間較短，故接下來的受體反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間都采用300min，即5h。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響Fig.2 Effects of reaction time on DP4 yield

2.2.2 加酶量對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 由圖3可見，當(dāng)加酶量不斷增加時(shí)，DP4糖的含量也逐漸增加，在加酶量小于0.3U/mL時(shí)，DP4的產(chǎn)量增加的比較明顯;當(dāng)加酶量大于0.3U/mL時(shí)，雖然加酶量增加了，但是DP4的產(chǎn)量增加得較為緩慢，考慮到酶液的利用率，以DP4產(chǎn)量/加酶量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，作為縱坐標(biāo)，加酶量為橫坐標(biāo)作圖，比較各種加酶量的條件下酶液的利用率。

圖3 加酶量對(duì)產(chǎn)物DP4含量的影響Fig.3 Effects of enzyme contents on DP4 yield

從DP4濃度/加酶量與加酶量的關(guān)系可以看出(圖4)，當(dāng)加酶量為0.3U/mL時(shí)，DP4濃度/加酶量的比例最大，即此時(shí)交替糖蔗糖酶的利用率較高;當(dāng)加酶量大于0.3U/mL時(shí)，DP4濃度/加酶量的比例減小，可見加酶量過大時(shí)，交替糖蔗糖酶的利用率反而降低，可能是因?yàn)榇藭r(shí)酶過量，產(chǎn)生抑制作用。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用0.3U/mL的加酶量。

圖4 DP4濃度/加酶量與加酶量的關(guān)系Fig.4 Correlation between enzyme content and DP4 yield/enzyme content

2.2.3 反應(yīng)體系pH對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 酶反應(yīng)體系的pH會(huì)影響交替糖蔗糖酶的活性，繼而可能會(huì)影響產(chǎn)物DP4糖的產(chǎn)量，故對(duì)不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)下反應(yīng)的 DP4 糖的含量進(jìn)行分析。所得結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)pH對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響Fig.5 Effects of reaction pH on DP4 yield

從圖5可以看出，pH對(duì)產(chǎn)物的影響還是比較大的。當(dāng)pH為3時(shí)，DP4糖的產(chǎn)量只有5g/L，而當(dāng)pH為4時(shí)，產(chǎn)量略有增加，達(dá)到約20g/L;當(dāng)pH為5時(shí)，DP4糖的產(chǎn)量最大，達(dá)到43.7g/L，而pH為6時(shí)，產(chǎn)量略有下降;但是pH為7時(shí)，產(chǎn)量又急劇下降，甚至在pH為8時(shí)，DP4產(chǎn)量很低。可見當(dāng)pH在5～6間時(shí)，DP4糖的產(chǎn)量最大，這與上清中的交替糖蔗糖酶酶的最適pH［8］是相符合的，故在接下來的實(shí)驗(yàn)中，采取pH為5.4的緩沖體系，即50mmol/L的pH5.4的NaAc-HAc緩沖液。

2.2.4 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 反應(yīng)體系的溫度會(huì)影響交替糖蔗糖酶的活性，進(jìn)而影響反應(yīng)產(chǎn)物DP4糖的含量。將相同的酶反應(yīng)體系于不同的溫度下反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物DP4糖的含量，所得結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響Fig.6 Effects of reaction temperature on DP4 yield

當(dāng)反應(yīng)溫度為25℃時(shí)，DP4糖產(chǎn)量約為28g/L，溫度升至30℃時(shí)，DP4糖產(chǎn)量大大增加，當(dāng)溫度升至40℃時(shí)，DP4糖產(chǎn)量達(dá)到最大值，接近50g/L;當(dāng)溫度繼續(xù)上升，DP4糖產(chǎn)量又急劇下降，當(dāng)溫度升至60℃時(shí)，DP4產(chǎn)量甚至為零，此時(shí)酶活可能已經(jīng)全部喪失。故確定最佳反應(yīng)溫度為40℃。

2.2.5 底物濃度比例對(duì)產(chǎn)物DP4糖含量的影響 在本實(shí)驗(yàn)的酶反應(yīng)體系中，蔗糖為供體分子，麥芽糖為受體分子，當(dāng)兩者的比例不同時(shí)，蔗糖分子作為供體分子提供葡糖基的情況，以及麥芽糖分子作為受體分子接受受體分子的情況都有可能不同。即當(dāng)蔗糖與麥芽糖濃度比例不同時(shí)，受體反應(yīng)的產(chǎn)物情況也不同，但產(chǎn)物大致都包括DP3糖，DP4糖和DP5糖。先采取不同的蔗糖與麥芽糖比例進(jìn)行酶反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物中的各成分含量。所得結(jié)果見圖7。

圖7 底物濃度比例對(duì)產(chǎn)物DP4糖、DP5糖、DP6糖含量的影響(S-蔗糖;M-麥芽糖)Fig.7 Effects of substrates concentrations on DP4 yield(S-sucrose;M-maltose)

由圖7可見，蔗糖與麥芽糖濃度的比例對(duì)于受體反應(yīng)的產(chǎn)物中DP3糖、DP4糖、DP5糖的分布影響很大。當(dāng)兩者的比例大于1∶1，即供體分子蔗糖的濃度大于受體分子麥芽糖的濃度時(shí)，受體產(chǎn)物中DP4糖的含量比DP3糖和DP5糖都高，DP3糖和DP4糖的含量都隨著受體分子麥芽糖濃度的增加而逐漸增大，DP5糖的含量變化幅度則不大。這可能是因?yàn)樵诠w分子充足的情況下，除了蔗糖分子可以作為受體分子外，其受體反應(yīng)產(chǎn)物DP3糖也可以作為受體分子，去競(jìng)爭(zhēng)供體分子上的葡萄糖基，從而合成DP4糖;同樣的，受體反應(yīng)產(chǎn)物DP4糖仍可以作為受體分子接受麥芽糖分子提供的葡萄糖基合成DP5糖。但是受體分子連接的葡糖基越多，其繼續(xù)競(jìng)爭(zhēng)葡糖基的能力也會(huì)下降［11-12］，故總體上DP3的產(chǎn)量最大，DP4次之，DP5的產(chǎn)量最少。DP5糖作為受體分子的競(jìng)爭(zhēng)葡萄糖基的能力很弱，故反應(yīng)體系中幾乎不存在聚合度大于5的低聚糖了。

當(dāng)供體分子蔗糖與受體分子麥芽糖的濃度比例小于1∶1，即受體分子的濃度大于供體分子的情況下，產(chǎn)物主要是DP3糖，DP4糖的產(chǎn)量也隨著受體分子的濃度的增大而減少，而DP5的產(chǎn)量減少的幅度更大，在蔗糖與麥芽糖兩者比例為1∶4和1∶5時(shí)，DP5產(chǎn)量甚至為零。這主要是由于受體分子麥芽糖的大量存在，導(dǎo)致供體分子相對(duì)不足，受體反應(yīng)中葡糖基的轉(zhuǎn)移大部分都以麥芽糖作為受體分子，而其受體反應(yīng)產(chǎn)物DP3只有少量的能競(jìng)爭(zhēng)到供體分子，合成DP4糖;而DP4糖作為受體分子，由于其碳鏈比麥芽糖、DP3糖長(zhǎng)，競(jìng)爭(zhēng)獲取供體分子上的葡萄糖基的能力更低，而且DP4含量本身也較少，所以合成DP5糖的能力就更低，導(dǎo)致合成的DP5的含量非常小。

從上述結(jié)果中可以看出，在交替糖蔗糖酶的受體反應(yīng)中，供體分子與受體分子的濃度比例對(duì)于產(chǎn)物中不同聚合度的低聚糖的分布有著較為明顯的影響。所以，在以后的研究中，可以通過對(duì)反應(yīng)體系中供體分子與受體分子的濃度比例的控制，有目的的來改變產(chǎn)物中不同聚合度的低聚糖的含量的分布，以獲得目的產(chǎn)物。本課題的目標(biāo)產(chǎn)物為DP4糖，故綜合上述分子，采用供體分子蔗糖與受體分子麥芽糖的濃度比例為1∶1。

2.2.6 受體反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖 由述實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)條件:100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖+0.3U/mL酶液，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)體系50mmol/L pH5.4的醋酸緩沖液的反應(yīng)體系，在該條件進(jìn)行受體反應(yīng)，其產(chǎn)物的HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，圖9為DP4標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果。

從圖8、圖9可以看出，在優(yōu)化條件下進(jìn)行的受體反應(yīng)產(chǎn)物中，除了殘余的底物(蔗糖和麥芽糖)以及副產(chǎn)物果糖外，主要低聚糖為DP3糖和DP4糖。結(jié)合DP4糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，經(jīng)計(jì)算，得出此條件下，DP4糖產(chǎn)量達(dá)52.8g/L，為本研究中最大產(chǎn)量。故確定受體反應(yīng)最優(yōu)條件。

3 結(jié)論

圖8 受體反應(yīng)產(chǎn)物HPLC圖Fig.8 HPLC of receptor reactions of alernansucrase

圖9 DP4糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.9 HPLC of DP4 standard

本實(shí)驗(yàn)采用的嗜檸檬酸明串珠菌Leuconostoc citreum SK24.002在蔗糖的誘導(dǎo)下可分泌交替糖蔗糖酶，該酶同時(shí)分泌于發(fā)酵液和菌種的細(xì)胞膜上，通過差異離心法確定了該酶的分布狀況，確定該酶主要分布在細(xì)胞膜上。該交替糖蔗糖酶可以以蔗糖為供體，麥芽糖為受體進(jìn)行受體反應(yīng)從而生產(chǎn)低聚糖，以產(chǎn)物中的DP4糖為指標(biāo)，進(jìn)行條件優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為:100g/L蔗糖+100g/L麥芽糖 +0.3U/mL酶液，反應(yīng)溫度為40°C，反應(yīng)體系50mmol/L pH5.4的醋酸緩沖液的反應(yīng)體系，在此條件下，低聚四糖的產(chǎn)量最高可達(dá)52.8g/L。

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