兼養(yǎng)對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用及藻株差異性

龍?jiān)?, 劉建國(guó) , 張立濤

(1.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2.南通中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋科學(xué)與技術(shù)研究與發(fā)展中心, 江蘇 南通226000; 3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

蝦青素是迄今為止人類所發(fā)現(xiàn)的自然界生物體內(nèi)最強(qiáng)的抗氧化劑, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)療衛(wèi)生、化妝品和保健品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景[1-2]。在脅迫條件下,雨生紅球藻能迅速合成并大量積累蝦青素, 是自然界中天然蝦青素的最佳生物來(lái)源[3]。但是與其他經(jīng)濟(jì)微藻相比, 雨生紅球藻生長(zhǎng)速度較慢、抵御敵害能力較差[4], 如何縮短培養(yǎng)周期、提高藻細(xì)胞產(chǎn)量是當(dāng)前雨生紅球藻蝦青素生產(chǎn)中需要致力解決的關(guān)鍵問(wèn)題。雨生紅球藻不僅能光合自養(yǎng), 同時(shí)可利用有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)及兼養(yǎng)生長(zhǎng)。紅球藻的兼養(yǎng)生長(zhǎng)由自養(yǎng)生長(zhǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)兩部分組成, 可有效提高紅球藻生長(zhǎng)速率和細(xì)胞產(chǎn)量[5]。在眾多有機(jī)物質(zhì)中, 乙酸鈉(NaAc)最易紅球藻吸收利用, 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)效果也最為明顯[6]。目前適宜雨生紅球藻生長(zhǎng)的乙酸鈉質(zhì)量濃度存在很大差異[7-8], 是否與藻株差異有關(guān)尚不清楚, 也缺少對(duì)兼養(yǎng)促進(jìn)紅球藻生長(zhǎng)機(jī)理上的深入研究。

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已被廣泛應(yīng)用于高等植物逆境生理研究, 近年來(lái)微藻脅迫生理分析也開(kāi)始應(yīng)用[9-10]。本研究以 4株不同品系雨生紅球藻為實(shí)驗(yàn)材料, 在紅球藻兼養(yǎng)細(xì)胞密度和比生長(zhǎng)速率分析基礎(chǔ)上, 結(jié)合葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)初步比較研究了兼養(yǎng)對(duì)不同紅球藻藻株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用及其機(jī)制, 目的為規(guī)?；a(chǎn)篩選適宜的兼養(yǎng)藻株并尋找最適乙酸鈉質(zhì)量濃度打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻種與基礎(chǔ)培養(yǎng)基

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)藻株H0、H2、H3、H6由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所藻類與藻類生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存, 基礎(chǔ)培養(yǎng)基選取MCM修正配方[11]。

1.2 培養(yǎng)方法

在修正 MCM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方基礎(chǔ)上, 通過(guò)添加0.5和1.5 g/L乙酸鈉(每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)重復(fù))建立兼養(yǎng)培養(yǎng)條件。在100 mL三角瓶中分別加入上述培養(yǎng)液60 mL, 于121℃高溫下滅菌15 min, 待冷卻后分別接種15 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的紅球藻H0、H2、H3和 H6藻液, 置于室內(nèi)培養(yǎng)架上靜置培養(yǎng), 以日光燈為光源, 光照強(qiáng)度1 200 lx, 光照和黑暗周期L∶D為14∶10, 培養(yǎng)溫度控制在24℃±1℃。每天隨機(jī)調(diào)換三角瓶位置, 使各處理組藻液所接受的光照盡可能一致, 同時(shí)每天充分搖動(dòng)三角燒瓶3~5次, 以增加藻細(xì)胞均勻度, 防止藻細(xì)胞發(fā)生貼壁生長(zhǎng), 連續(xù)培養(yǎng)觀察8~10 d, 每隔48 h從各處理組藻液中均勻取樣2 mL, 用于細(xì)胞生長(zhǎng)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定。

1.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)、OD值測(cè)定與比生長(zhǎng)速率計(jì)算

細(xì)胞顯微觀察計(jì)數(shù): 藻液中紅球藻細(xì)胞數(shù)量,采用血球計(jì)數(shù)板結(jié)合顯微觀察計(jì)數(shù)的方法測(cè)得, 為減少人工帶來(lái)的可能統(tǒng)計(jì)誤差, 取樣前充分搖勻藻液, 每個(gè)樣本至少重復(fù)統(tǒng)計(jì) 20次, 細(xì)胞密度以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示; 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率按照公式:μ=(lnN2－lnN1)/(T2－T1)計(jì)算, 式中μ為比生長(zhǎng)速率(d-1),N2是T2時(shí)的細(xì)胞密度,N1是T1時(shí)的細(xì)胞密度[12]; 光吸收密度變化間接反映藻細(xì)胞生物量的變化, 所以藻細(xì)胞的生長(zhǎng)同時(shí)采用 750 nm 波長(zhǎng)光吸收值(A)表示, 利用722 型可見(jiàn)分光光度計(jì)和1 cm光徑比色杯測(cè)定。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

藻液取樣反應(yīng)杯中暗適應(yīng)15 min后, 利用英國(guó)Hansatech 公司Handy Pea 便攜式植物效率分析儀,測(cè)定相關(guān)葉綠素?zé)晒鈪?shù)。從分析儀上直接讀取以吸收光能為基礎(chǔ)、可準(zhǔn)確反映植物細(xì)胞光合機(jī)構(gòu)狀態(tài)的性能指數(shù) PIABS值[13]。結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)和 PIABS的變化規(guī)律, 進(jìn)一步分析兼養(yǎng)對(duì) 4株紅球藻細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Sigmaplot軟件作圖。用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、方差分析以及多重比較(LSD)。

2 結(jié)果

2.1 兼養(yǎng)與光自養(yǎng)條件下紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)比

在兼養(yǎng)和光自養(yǎng)培養(yǎng)條件下, 4株紅球藻細(xì)胞密度變化如圖1所示。結(jié)果表明: 相對(duì)于自養(yǎng)而言, 兼養(yǎng)更有利于紅球藻細(xì)胞密度增加, 實(shí)驗(yàn) 4株藻株在兼養(yǎng)條件下細(xì)胞密度最高可達(dá)到自養(yǎng)的3倍(圖1a)。不同藻株對(duì)乙酸鈉的反應(yīng)及其適宜生長(zhǎng)質(zhì)量濃度存在明顯差異性。在 1.5 g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度兼養(yǎng)時(shí),藻株 H0細(xì)胞密度相較自養(yǎng)顯著上升(P<0.01), 第 6天細(xì)胞密度達(dá)到 53.2×104個(gè)/mL, 而此時(shí)自養(yǎng)的 H0細(xì)胞只有19.5×104個(gè)/mL; 0.5 g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下兼養(yǎng), 藻株H0細(xì)胞生長(zhǎng)較自養(yǎng)有一定程度的增加(圖1a) 但尚不顯著(P>0.05)。相反, 0.5 g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下兼養(yǎng), 藻株 H2細(xì)胞密度相較自養(yǎng)呈現(xiàn)顯著增高(P<0.05), 到培養(yǎng)后期甚至超過(guò) 1.5 g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下兼養(yǎng)的細(xì)胞密度(圖1b)。藻株H3細(xì)胞密度在第8天達(dá)到最大值, 0.5和1.5 g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下兼養(yǎng)的細(xì)胞密度分別接近自養(yǎng)的 1.5和 2倍(圖1c)。圖1中, H0、H2和H3兼養(yǎng)的細(xì)胞密度從培養(yǎng)第8天才開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降, 而藻株 H6在兼養(yǎng)的第 6天細(xì)胞密度達(dá)到最高后開(kāi)始下降(圖1d)。此外, H6兼養(yǎng)細(xì)胞密度的上升幅度在 4株藻株中最小。盡管適宜于不同藻株生長(zhǎng)的乙酸鈉質(zhì)量濃度尚不十分確定,但上述結(jié)果至少表明, 適宜紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的乙酸鈉質(zhì)量濃度大致可在1.5g/L左右。

圖1 4株紅球藻藻株在自養(yǎng)和兼養(yǎng)(NaAc+光)條件下的細(xì)胞密度變化Fig.1 Variation of cell densities in four strains of H. pluvialis under photoautotrophic and mixotrophic (NaAc + light) growth conditions

對(duì)比兼養(yǎng)和光自養(yǎng)條件下紅球藻比生長(zhǎng)速率的變化趨勢(shì)(圖2)可以發(fā)現(xiàn), 4株紅球藻比生長(zhǎng)速率在兼養(yǎng)條件下均明顯高于自養(yǎng)培養(yǎng), 兼養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)效果在培養(yǎng)前期更顯著(P<0.05)。其中, 兼養(yǎng)對(duì)藻株H2的比生長(zhǎng)速率的促進(jìn)作用最大(圖2b), 對(duì)藻株H6比生長(zhǎng)速率的促進(jìn)作用最小(圖2d); 同時(shí), 隨著培養(yǎng)的進(jìn)行, 兼養(yǎng)促進(jìn)紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng)均呈線性下降趨勢(shì), 到培養(yǎng)后期兼養(yǎng)與自養(yǎng)的比生長(zhǎng)速率已經(jīng)比較接近; 另外十分有意思的是, 兼養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)的促進(jìn)作用在紅球藻藻株之間也存在明顯差異, 比生長(zhǎng)速率最快的H2藻株的和比生長(zhǎng)速率最慢的H6藻株與乙酸鈉質(zhì)量濃度之間(圖2b, 圖2d) 均未呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng), 而比生長(zhǎng)速率介于中間的H0和H3藻株與乙酸鈉質(zhì)量濃度之間(圖2a, 圖2c)表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng), 并且其比生長(zhǎng)速率皆在 1.5g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下出現(xiàn)進(jìn)一步的明顯上升。可見(jiàn)1.5g/L乙酸鈉可作為紅球藻生長(zhǎng)的適宜質(zhì)量濃度, 這與細(xì)胞密度的分析結(jié)果基本一致。

圖2 不同乙酸鈉劑量下4株紅球藻比生長(zhǎng)速率的變化Fig.2 Changes in specific growth rate of four strains of H. pluvialis exposed to NaAc at different concentrations

2.2 兼養(yǎng)對(duì)紅球藻光合綜合指數(shù)(PIABS)的影響

光合綜合性能指數(shù) PIABS=(RC/ABS)·[φPo/(1–φPo)]·[φo/(1–φo)]包含了 RC / ABS、φPo和φo共 3個(gè)參數(shù), 其分別代表反應(yīng)中心的運(yùn)行效率、光能吸收效率和電子傳遞效率, 并且3個(gè)參數(shù)相互獨(dú)立。所以性能指數(shù)PIABS對(duì)環(huán)境因子更敏感, 能夠更準(zhǔn)確地反映植物光合機(jī)構(gòu)的狀態(tài)[13]。4株紅球藻在自養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)條件下的光合綜合指數(shù) PIABS值的變化(圖3)結(jié)果表明: 在培養(yǎng)前期(一般為前 2 d), 兼養(yǎng)培養(yǎng)的藻株(如H0、H2、H6) PIABS值較自養(yǎng)培養(yǎng)的低, 之后開(kāi)始呈現(xiàn)不同程度上升。到培養(yǎng)后期(一般后2~4 d天),兼養(yǎng)培養(yǎng)藻株的PIABS值較自養(yǎng)培養(yǎng)明顯升高, 其中藻株 H0、H2(圖3a, 圖3b) 分別在1.5和0.5 g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下 PIABS值較其自養(yǎng)顯著上升(P<0.05)。與其他3株實(shí)驗(yàn)藻株不同, 藻株H3在培養(yǎng)初期兼養(yǎng)生長(zhǎng)的 PIABS值與自養(yǎng)基本一致, 在 4~6 d H3兼養(yǎng)生長(zhǎng)的PIABS值低于自養(yǎng)培養(yǎng), 到第8天兼養(yǎng)的PIABS值才明顯高于其自養(yǎng)(圖3c)。上述結(jié)果表明,添加乙酸鈉兼養(yǎng)對(duì)紅球藻生長(zhǎng)有促進(jìn)作用, 該促進(jìn)作用不僅在于乙酸鈉為紅球藻提供了異養(yǎng)生長(zhǎng)的有機(jī)碳源, 同時(shí)還改變了紅球藻的光合生理狀態(tài), 并且可將兼養(yǎng)對(duì)紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用分為兩個(gè)階段: 在兼養(yǎng)前期主要通過(guò)乙酸鈉異養(yǎng)加快細(xì)胞生長(zhǎng); 而培養(yǎng)后期當(dāng)乙酸鈉快要耗盡時(shí), 兼養(yǎng)通過(guò)提高藻細(xì)胞的光自養(yǎng)能力進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.3 不同乙酸鈉質(zhì)量濃度下 4株紅球藻生長(zhǎng)及生理指標(biāo)的對(duì)比

在不同乙酸鈉質(zhì)量濃度下, 各藻株生長(zhǎng)和生理指標(biāo)(表1)顯示, 細(xì)胞從自養(yǎng)進(jìn)入兼養(yǎng), 紅球藻藻株之間呈現(xiàn)出某些共性和差異性變化, 主要包括:

(1) 隨乙酸鈉質(zhì)量濃度上升, 反映細(xì)胞密度的A750nm均呈逐漸上升趨勢(shì), 而在培養(yǎng)前期各藻株的光合性能綜合指數(shù)PIABS則呈相反的趨勢(shì)漸次下降, 這表明在培養(yǎng)前期兼養(yǎng)促進(jìn)細(xì)胞密度的增加并非由其中光自養(yǎng)部分貢獻(xiàn)的, 而主要是由其中異養(yǎng)作用所導(dǎo)致。

圖3 乙酸鈉兼養(yǎng)對(duì)紅球藻光合綜合指數(shù)(PIABS)的影響Fig.3 Influences of NaAc on photosynthetic performance index (PIABS) in four strains of H. pluvialis under mixotrophic conditions

表1 不同乙酸鈉質(zhì)量濃度兼養(yǎng)對(duì)4株紅球藻生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Tab.1 Influences of diverse NaAc concentrations on various growth indexes of four H. pluvialis strains under mixotrophic (NaAc + light) conditions

(2) 在藻株之間, 自養(yǎng)與兼養(yǎng)的平均比生長(zhǎng)速率、后期光合性能指數(shù)PIABS指標(biāo)存在明顯差異性。藻株H2和藻株H6表現(xiàn)基本一致可劃為一組, 而藻株H0和藻株 H3大致類似為另外一組; 后者(藻株 H0、H3)的平均比生長(zhǎng)速率和后期光自養(yǎng)綜合指數(shù)由自養(yǎng)轉(zhuǎn)入兼養(yǎng)后, 隨乙酸鈉質(zhì)量濃度增加而增高; 而前者(藻株H2、H6)從自養(yǎng)轉(zhuǎn)入兼養(yǎng)后, 平均比生長(zhǎng)速率明顯增高, 但此時(shí)兼養(yǎng)的平均比生長(zhǎng)速率與乙酸鈉質(zhì)量濃度之間不存在明顯劑量效應(yīng), 只是在后期的PIABS與乙酸鈉質(zhì)量濃度存在劑量關(guān)系, 呈現(xiàn)先增高再下降的趨勢(shì)變化, 皆在 0.5g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下光合性能綜合指數(shù)最高。

(3) 自養(yǎng)與兼養(yǎng)培養(yǎng)效率反映在最大比生長(zhǎng)速率、平均光合性能指數(shù)PIABS指標(biāo)上, 藻株之間也存在出明顯的差異性。藻株H2、H3、H6大致一致可劃為一組, 主要表現(xiàn)在 0.5g/L質(zhì)量濃度下最大比生長(zhǎng)速率最高、光合性能綜合指數(shù)最大; 藻株 H0單獨(dú)為另一組, 1.5g/L乙酸鈉質(zhì)量濃度下其最大比生長(zhǎng)速率最高、光合性能綜合指數(shù)也最大。

3 討論

微藻高密度培養(yǎng)是獲得生物質(zhì)的基礎(chǔ), 同時(shí)也是節(jié)約后續(xù)生產(chǎn)成本的重要手段[14]。添加有機(jī)碳兼養(yǎng)是獲得高密度藻細(xì)胞生物質(zhì)的重要方法之一。兼養(yǎng)生長(zhǎng)由光合自養(yǎng)及異養(yǎng)兩部分構(gòu)成, 其最大特點(diǎn)是能同時(shí)利用光能和有機(jī)碳源進(jìn)行生長(zhǎng)[15], 可最大程度地加快藻細(xì)胞生長(zhǎng), 有機(jī)碳源提供的能量可減輕藻細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)光合作用的依賴。本研究中, 乙酸鈉的添加不同程度地提高了 4株實(shí)驗(yàn)藻株的比生長(zhǎng)速率和細(xì)胞產(chǎn)量, 這與前期相關(guān)研究基本一致[5,8]。在紅球藻兼養(yǎng)研究上, Kobayashi等[5]認(rèn)為光合生長(zhǎng)與乙酸鈉異養(yǎng)代謝可同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行, 兼養(yǎng)生長(zhǎng)速率是單獨(dú)自養(yǎng)與異養(yǎng)生長(zhǎng)的總和。莊惠如等[6]也進(jìn)一步證實(shí)紅球藻兼養(yǎng)生物量幾乎等于光養(yǎng)型生長(zhǎng)與化能異養(yǎng)的總和。

本研究通過(guò)對(duì)比多株紅球藻兼養(yǎng)與自養(yǎng)的結(jié)果發(fā)現(xiàn): 添加乙酸鈉兼養(yǎng)提高了紅球藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率, 該促進(jìn)作用并不是簡(jiǎn)單地歸納為提供有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)和自養(yǎng)的相加, 事實(shí)上乙酸鈉還導(dǎo)致藻細(xì)胞光合生理狀態(tài)在前期和后期發(fā)生改變(圖3、表1),并且該光合生理狀態(tài)改變可能與乙酸鈉消耗程度也存在一定的關(guān)聯(lián)性。基于藻株對(duì)乙酸鈉的適應(yīng)性及利用率的差別, 各藻株光合生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)變?cè)跁r(shí)間上以及乙酸鈉劑量效應(yīng)上雖然存在一定差異, 但乙酸鈉導(dǎo)致光合生理狀態(tài)發(fā)生改變?cè)诓煌t球藻藻株都得到了印證。兼養(yǎng)的培養(yǎng)效果并非自養(yǎng)與異養(yǎng)的簡(jiǎn)單疊加, 其中還存在其他多種綜合性效應(yīng)。關(guān)于這方面深一步的研究甚少, 是下一步需要探明的基礎(chǔ)科學(xué)理論及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)關(guān)注的重要應(yīng)用技術(shù)。上述結(jié)果與 Yu等[15]在對(duì)發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌兼養(yǎng)得到的結(jié)論基本類似, 即在培養(yǎng)的不同階段, 兼養(yǎng)生長(zhǎng)獲得的細(xì)胞產(chǎn)量與其對(duì)應(yīng)的自養(yǎng)和異養(yǎng)生長(zhǎng)總和的關(guān)系是波動(dòng)的, 并非兩者的簡(jiǎn)單相加。因此, 深入了解兼養(yǎng)下紅球藻的生長(zhǎng)規(guī)律、掌握添加乙酸鈉的適宜質(zhì)量濃度是非常有必要的, 進(jìn)而有可能獲得紅球藻快速異養(yǎng)生長(zhǎng)同時(shí)又顯著促進(jìn)藻細(xì)胞光自養(yǎng)生長(zhǎng)的雙重增益效果, 相反也有可能造成其作用部分抵消。

微藻異養(yǎng)需充足的有機(jī)碳源, 但乙酸鈉質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)嚴(yán)重抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)[6,16]。本研究中, 添加乙酸鈉可獲得相對(duì)較高的藻細(xì)胞生物量, 但不同藻株所需添加的乙酸鈉存在差異, 某些藻株(如 H2)在相對(duì)低的乙酸鈉質(zhì)量濃度下(0.5g/L)細(xì)胞生長(zhǎng)更好,細(xì)胞密度(圖1b、表1)、比生長(zhǎng)速率(圖2b、表1)和綜合光合性能指數(shù)(圖3b、表1)都達(dá)到最大; 而另外一些藻株, 如H0則在較高乙酸鈉質(zhì)量濃度(1.5g/L)下兼養(yǎng)效果更好, 無(wú)論細(xì)胞密度(圖1a、表1), 比生長(zhǎng)速率(圖2a、表1)和綜合光合性能指數(shù)(圖3a、表1)均在1.5g/L乙酸鈉下達(dá)到最高值。根據(jù)不同藻株, 具體分析選擇合適的乙酸鈉添加量是獲得最佳培養(yǎng)效果的前提, 不能簡(jiǎn)單地隨意添加。

對(duì)微藻生長(zhǎng)情況的分析, 常通過(guò)建立細(xì)胞密度與藻液光密度值的相關(guān)方程, 以簡(jiǎn)便快捷的光密度法檢測(cè)微藻的生長(zhǎng)和生物量變化[17]。我們注意到乙酸鈉兼養(yǎng)不僅影響紅球藻細(xì)胞數(shù)量而且也影響細(xì)胞大小, 單憑光密度法檢測(cè)藻細(xì)胞生物量的變化準(zhǔn)確性易受到干擾, 因而產(chǎn)生偏差。這也可能與紅球藻生活史復(fù)雜[2,7]有關(guān), 在不同培養(yǎng)模式下處于不同生長(zhǎng)階段的紅球藻細(xì)胞大小差異很大, 有時(shí)細(xì)胞直徑相差1~2倍, 細(xì)胞體積變化幅度高達(dá)數(shù)十倍, 無(wú)論光密度還是細(xì)胞數(shù)量等單一指標(biāo)都不能準(zhǔn)確反應(yīng)其生物量變化, 應(yīng)結(jié)合多種指標(biāo)從不同角度全面檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)變化才更客觀、科學(xué)[18]。然而, 多指標(biāo)測(cè)定勢(shì)必存在工作繁重、耗時(shí)長(zhǎng)、樣本需要量大的問(wèn)題[6],有時(shí)會(huì)僅限于宏觀和過(guò)后結(jié)果分析, 很難及時(shí)、快速掌握培養(yǎng)過(guò)程藻細(xì)胞的具體生長(zhǎng)狀態(tài)。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可對(duì)紅球藻的兼養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行快速追蹤, 通過(guò)以吸收光能為基礎(chǔ)的性能指數(shù)PIABS可及時(shí)有效反映不同乙酸鈉質(zhì)量濃度下紅球藻細(xì)胞的即時(shí)生理狀態(tài), 并提供細(xì)致、全面的數(shù)據(jù)參考, 從而可對(duì)培養(yǎng)條件及時(shí)調(diào)整, 實(shí)現(xiàn)最佳培養(yǎng)效果。葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)具備快速、靈敏、操作簡(jiǎn)單、用量少等特點(diǎn)[13], 可作為紅球藻等微藻生理機(jī)理及生產(chǎn)應(yīng)用研究有力、便捷的工具。

在兼養(yǎng)培養(yǎng)初期, 藻細(xì)胞性能指數(shù)PIABS相較自養(yǎng)生長(zhǎng)出現(xiàn)下降(圖3、表1), 可能是由于實(shí)驗(yàn)接種藻細(xì)胞來(lái)源于自養(yǎng)培養(yǎng), 在接種后藻細(xì)胞對(duì)乙酸鈉環(huán)境需要一段時(shí)間進(jìn)行適應(yīng)。如果采用乙酸鈉兼養(yǎng)培養(yǎng)的藻種有可能避免此問(wèn)題, 是否如此尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。隨著培養(yǎng)進(jìn)行, 藻液中乙酸鈉和營(yíng)養(yǎng)鹽不斷消耗, 藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率(圖2)逐漸下降, 到第 6天細(xì)胞增長(zhǎng)幅度(圖1)呈現(xiàn)出明顯拐點(diǎn)。因此, 單就生物產(chǎn)量的有效獲得而言, 理論上生產(chǎn)周期維持在一周可保證藻細(xì)胞良好的繁殖狀態(tài)以及生物產(chǎn)量的高效供應(yīng), 這也是下一步生產(chǎn)性半連續(xù)培養(yǎng)中需要控制的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

紅球藻生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢, 沒(méi)有小球藻的快速繁殖力, 也不像螺旋藻、杜氏鹽藻等其他經(jīng)濟(jì)微藻能夠在極端環(huán)境中生長(zhǎng), 因此其抵抗敵害生物能力較弱[4]。有機(jī)碳源(乙酸鈉)的添加在促進(jìn)紅球藻生長(zhǎng)的同時(shí), 也加大了異養(yǎng)敵害生物的侵染風(fēng)險(xiǎn)。如何控制敵害生物污染, 把控好紅球藻細(xì)胞快速繁殖與敵害污染問(wèn)題之間的平衡關(guān)系, 是目前紅球藻規(guī)?；骛B(yǎng)生產(chǎn)蝦青素急需突破的難題[3]。而生長(zhǎng)速率的提高、培養(yǎng)過(guò)程紅球藻細(xì)胞良好生理狀態(tài)的維持皆有助于紅球藻抵御敵害的污染和競(jìng)爭(zhēng)。所以在乙酸鈉適宜質(zhì)量濃度的選擇上需進(jìn)行綜合考慮, 在保證紅球藻快速生長(zhǎng)的同時(shí), 還需結(jié)合考慮乙酸鈉的添加對(duì)紅球藻光合自養(yǎng)生長(zhǎng)促進(jìn)作用的增益效應(yīng)、保障藻細(xì)胞良好的生理狀態(tài)。

綜上所述, 0.5~1.5g/L乙酸鈉兼養(yǎng)對(duì)紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用, 該促進(jìn)作用在培養(yǎng)的前期主要通過(guò)乙酸鈉提供紅球藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)加快細(xì)胞生長(zhǎng); 培養(yǎng)后期乙酸鈉逐漸耗盡, 兼養(yǎng)通過(guò)提高紅球藻的光自養(yǎng)能力促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí), 兼養(yǎng)對(duì)紅球藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用存在明顯的藻株差異性, 不同藻株對(duì)乙酸鈉的需求量并不一致, 生產(chǎn)上需針對(duì)具體藻株添加適量的乙酸鈉, 實(shí)現(xiàn)生物量的有效增加。

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