提高觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)效果研究

王小玲，高 柱，劉騰云，譚胤靜，余發(fā)新*

(1.江西省科學院 生物資源研究所/江西省重金屬污染生態(tài)修復工程技術研究中心，江西 南昌 330096;2.江西省鄱陽湖重點實驗室，江西 南昌 330096)

觀賞羽扇豆因其特殊的花語、特別的植株形態(tài)、豐富的花序顏色和較高的經(jīng)濟用途而被廣泛利用。觀賞羽扇豆為自花授粉植物，通過近年的研究發(fā)現(xiàn)，在各省引種栽培后，種子結(jié)實率低，飽滿度不夠，主要以進口為主，成本較高［1］。植物組織培養(yǎng)法繁殖的突出特點是快速，且具有幾乎不受地理環(huán)境和季節(jié)限制、遺傳背景一致、生長周期短、成本低等諸多優(yōu)點，因此對觀賞羽扇豆這種“名、優(yōu)、特、新、奇”品種的繁殖意義重大。然而，污染、褐化和玻璃化被認為是花卉組織培養(yǎng)技術環(huán)節(jié)中存在的三大殺手，會給科研和生產(chǎn)實踐帶來巨大危害。因此采取有效的防控措施，降低污染率發(fā)生的幾率，有效控制褐化和玻璃化現(xiàn)象，是實現(xiàn)花卉組織培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)的重要保障。

目前，對于觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)的研究還主要集中在生長激素對不定芽誘導、增殖和生根的影響方面［2-3］，對于如何減少污染及控制褐化和玻璃化現(xiàn)象的研究鮮有報道。本研究通過正交試驗方法，研究不同因素水平對觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)過程中的污染、褐化和玻璃化現(xiàn)象的影響，建立高效的觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)種苗生產(chǎn)體系，為其進一步的生理學、病理學、遺傳學、育種學以及生物化學等領域的研究提供技術手段，提高觀賞羽扇豆工廠化育苗方面產(chǎn)生的巨大經(jīng)濟和社會效益。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的觀賞羽扇豆種子購自浙江虹越花卉有限公司，試管苗材料由江西省科學院生物資源研究所培育。

1.2 試驗方法

1.2.1 污染防止處理 將觀賞羽扇豆種子在4℃低溫下預處理15 d 后，選取均勻、飽滿種子，自來水室溫條件下浸泡4～6 h，使其吸水膨脹后，用流水沖洗30 min。預處理種子分別使用0.1%高錳酸鉀、70%乙醇和0.1%升汞，按照L9(34)正交表進行3 因素3 水平試驗處理，因素水平見表1。處理好的種子接種到MS+6 g/L 瓊脂+45 g/L 白糖培養(yǎng)基上，每組處理3 個重復，每個重復接種30 粒種子，培養(yǎng)25 d 后，統(tǒng)計污染率。

表1 污染防止L9(34)正交因素水平Tab.1 L9(34)orthogonal factors and levels of pollution control

1.2.2 褐化控制處理 預處理的觀賞羽扇豆種子按照1.2.1 方法選取的適宜組合消毒后，分別接種到添加吸附劑(活性炭、聚乙烯吡咯烷酮)和抗氧化劑(維生素C、檸檬酸)的MS+0.5 g/L 6-BA+6 g/L瓊脂+45 g/L 白糖培養(yǎng)基上，吸附劑和抗氧化劑的處理濃度見表2。每處理3 個重復，每個重復接種30粒種子，培養(yǎng)25 d 后，統(tǒng)計褐化率。

1.2.3 玻璃化控制處理 隨機選取觀賞羽扇豆第一次繼代培養(yǎng)后的正常苗和玻璃化苗，利用干重法測定組織含水量，丙酮法［4］測定葉綠素含量，蒽酮比色法［5］測定可溶性糖和淀粉含量。

將選取的觀賞羽扇豆第一次繼代培養(yǎng)后的正常苗，接種到按照L16(45)正交表進行的4 因素3 水平試驗處理組合中，因素水平見表3。基本培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.8 mg/L GA3+2 g/L AC。每組處理3 個重復，每個重復接種30 個正常苗，培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計玻璃化率。

表2 吸附劑與抗氧化劑處理Tab.2 Treatments of absorbents and antioxidants to control browning

表3 玻璃化控制L16(45)正交因素水平Tab.3 L16(45)orthogonal factors and levels of hyperhydric control

2 結(jié)果與分析

2.1 觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)污染防止研究

通過調(diào)查分析，可用于組織培養(yǎng)外植體消毒的方法很多［6］，如升汞、雙氧水、次氯酸鈉、高錳酸鉀、碘化鉀、乙醇等等。經(jīng)全面考慮以及在以往試驗的基礎上［3］，本研究最后確定0.1%高錳酸鉀、70%乙醇和0.1%升汞為試驗因素，進行3 因素3 水平正交試驗，結(jié)果見表4。一方面，根據(jù)正交試驗的特性和試驗指標污染率，KA2＜KA3＜KA1、KB2＜KB3＜KB1、KC3＜KC2＜KC1，可斷定A2、B2和C3分別為A、B、C 三因素的優(yōu)水平。三個因素的優(yōu)水平組合A2B2C3為本試驗的最優(yōu)水平組合，即觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)消毒的最優(yōu)方法為0.1%高錳酸鉀30 min，70%乙醇40 s，0.1%升汞9 min。另一方面，根據(jù)極差Rj的大小，可以判斷各因素對試驗指標的影響主次。比較本試驗各R 值的大小，可見RC＞RA＞RB，所以三因素對污染率影響的主→次順序是C→A→B，即0.1%升汞影響最大，其次是0.1%高錳酸鉀，70%乙醇影響較小。其原因可能是0.1%高錳酸鉀可有效清洗掉觀賞羽扇豆種子表面的菌類物質(zhì)，而升汞則可徹底殺死種子胚乳表面殘留的菌類物質(zhì)，所以兩者配合可有效降低污染率。

2.2 觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)褐化控制研究

處理好的觀賞羽扇豆種子接種到添加不同濃度的吸附劑(表5)和抗氧化劑(表6)的培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示，培養(yǎng)25 d 后，添加活性炭、PVP、維生素C 和檸檬酸的外植體平均褐化率分別是8.3%、13.0%、15.0%和10.8%，均顯著低于CK，其中吸附劑活性炭效果最好，抗氧化劑檸檬酸次之。添加1.0 g/L 活性炭時，平均褐化率比CK 顯著降低了6.4%，褐化程度較輕;添加2.0 g/L 活性炭時，平均褐化率最低，比CK 顯著降低了12.3%，褐化程度最輕;當活性炭濃度增加到3.0 g/L，平均褐化率反而顯著提高(比CK 降低了9.2%)。由此表明，活性炭可顯著降低觀賞羽扇豆種子褐化率，但當活性炭增加到一定濃度時，高濃度的活性炭在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時，也吸附了培養(yǎng)基中的無機鹽、激素等營養(yǎng)成分［7］，致使培養(yǎng)基中的有效成分發(fā)生改變，不利于外植體誘導，褐化程度相對加重，因此必須選擇合適的活性炭濃度。

表4 污染防止L9(34)正交試驗方案及結(jié)果Tab.4 L9(34)orthogonal experimental program and result of pollution control

表5 吸附劑對褐化的影響及結(jié)果Tab.5 Effect and result of absorbents on browning control

表6 可知，觀賞羽扇豆褐化率同時受抗氧化劑種類和抗氧化劑濃度的影響，其中檸檬酸對觀賞羽扇豆褐化抑制效果較維生素C 顯著，且濃度越高，褐化率就越低，褐化程度越輕。試驗觀察結(jié)果還表明，隨著檸檬酸濃度的升高，觀賞羽扇豆誘導苗生長狀況緩慢。這可能是檸檬酸促使外植體氧化酶活性降低，同時抑制總酚的生成和擴散，有效控制培養(yǎng)基褐變的產(chǎn)生，但當檸檬酸濃度過高時，植物細胞滲透勢增大，造成膜破壞，影響生長［8］。綜合考慮檸檬酸對觀賞羽扇豆褐化抑制和生長的影響，還有待于進一步研究檸檬酸的適宜濃度，或者研究吸附劑和抗氧化劑聯(lián)合使用效果。

表6 抗氧化劑對褐化的影響及結(jié)果Tab.6 Effect and result of antioxidants on browning control

選取吸附劑(活性炭2.0 g/L)和抗氧化劑(檸檬酸5.0 g/L)2 個處理和CK，進行觀賞羽扇豆褐變變化趨勢分析。結(jié)果顯示(圖1)，3 個處理的褐化率增長趨勢為CK＞檸檬酸＞活性炭;且均在25 d 以內(nèi)培養(yǎng)時，褐化率增幅較小;培養(yǎng)超過25 d 后，褐化率增幅明顯增大。其中CK 在培養(yǎng)第5 天最早發(fā)現(xiàn)褐變，檸檬酸在培養(yǎng)第10 天發(fā)現(xiàn)褐變，活性炭在培養(yǎng)第15 天最晚發(fā)現(xiàn)褐變。隨著培養(yǎng)時間的推移，褐變越嚴重，不同處理之間褐化率差異逐漸縮小。因此，觀賞羽扇豆外植體培養(yǎng)的周期應控制在25 d 之內(nèi)。

2.3 觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)玻璃化控制研究

觀賞羽扇豆試管苗在相同培養(yǎng)條件下，第1 次繼代培養(yǎng)25 d 后，取苗高相對一致的正常苗和玻璃化苗，測定其生理生化的變化結(jié)果(表7)顯示，玻璃化苗和正常苗生理生化指標存在顯著差異。其中，玻璃化苗組織含水量、葉綠素a/b 比值和可溶性糖含量分別比正常苗顯著高出3.2%，0.63，3.39 mg/L;與其相反，玻璃化苗葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量、淀粉含量和干物質(zhì)積累卻分別比正常苗顯著降低了0.48，0.18，0.62，2.46 mg/L 和21%。說明玻璃化苗干物質(zhì)積累降低，葉綠素含量減少，光合能力減弱，導致光合直接產(chǎn)物可溶性糖轉(zhuǎn)化力和光合積累產(chǎn)物淀粉合成能力下降。

圖1 培養(yǎng)天數(shù)對3 種處理褐化率的影響Fig.1 Effect of culture days on browning rate of three treatments

表7 正常苗與玻璃化苗生理生化指標對比結(jié)果Tab.7 Physiological and biochemical results of normal and hyperhydric shoots

表8 研究了不同水平組合的蔗糖、瓊脂、培養(yǎng)溫度和光照時間對觀賞羽扇豆第1 次繼代后的試管苗產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)條件一致情況下，蔗糖2(30 g/L)、瓊脂3(6 g/L)、培養(yǎng)溫度2(20 ℃)和光照時間3(14 h)組合時，試管苗玻璃化率最低為3.1%。對玻璃化率影響最大的因素是培養(yǎng)溫度，其次是蔗糖和瓊脂濃度，光照時間的影響最小。

表8 玻璃化控制L16(45)正交試驗方案及結(jié)果Tab.8 L16(45)orthogonal experimental program and result of hyperhydric control

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是花卉組織培養(yǎng)體系建立過程中的首要基礎工作，也是最關鍵的步驟，消毒方法選擇不合理，將會引起嚴重的污染問題。大量研究表明，不同植物適宜的消毒方法差異很大。鄭穎等［9］采用0.1%升汞消毒臺灣榿木外植體9 min，并在培養(yǎng)基中添加50 mg/L 利福平、20 mg/L 鹽酸四環(huán)素或40 mg/L鹽酸四環(huán)素可將污染率控制在7.2%～15.6%。而大葉藻種子最好的消毒方法則是，分別用75%乙醇和1.5% KI 處理10 min，且不影響后續(xù)種子的萌發(fā)［6］。本研究中選取了3 種常用的種子消毒劑，進行了不同處理時間組合對觀賞羽扇豆種子消毒效果影響的研究。結(jié)果顯示，用0.1%高錳酸鉀浸泡30 min，再用70%乙醇處理40 s，最后用0.1%升汞處理9 min 是觀賞羽扇豆種子消毒的較好方法。而對于在培養(yǎng)中添加抗生素能否抑制觀賞羽扇豆組織培養(yǎng)過程中菌污染的影響，還有待于進一步開展研究。

在培養(yǎng)基中，加入抗壞血酸、檸檬酸、硫代硫酸鈉、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮等抗氧化劑，利用這些物質(zhì)的還原性，可有效抑制酚類物質(zhì)的氧化，從而降低褐化的發(fā)生。附加抗壞血酸0.125 g/L、亞硫酸鈉0.125 g/L 和檸檬酸2.5 g/L 的MS 培養(yǎng)基，可明顯抑制3 個大花蕙蘭品種產(chǎn)生褐變［10］。闕生全［11］在各種配比的培養(yǎng)基中，以添加吸附劑(活性炭和PVP)的培養(yǎng)基控制茶樹的褐變效果最好;添加抗氧化劑的培養(yǎng)基褐化較嚴重，其中添加硫代硫酸鈉培養(yǎng)的外植體褐化最嚴重。本研究結(jié)果則證明，單獨添加吸附劑和抗氧化劑均能抑制觀賞羽扇豆褐變的發(fā)生，其中吸附劑活性炭2.0 g/L 的抑制效果最好，抗氧化劑檸檬酸5.0 g/L 的抑制效果次之。然而，除吸附劑和抗氧化劑的種類外，還和其濃度有關，也有待進一步探索復合吸附劑或復合抗氧化劑比例是否對抑制褐化效果更好。

玻璃化是植物組織培養(yǎng)中試管苗的一種生理失調(diào)癥狀，嚴重影響組培快繁體系的穩(wěn)定性，造成人力、財力、物力的極大浪費。植物種類不同，引起試管苗被玻璃化的主導因素也存在一定差異。防風［12］組織培養(yǎng)過程中，增加培養(yǎng)基內(nèi)瓊脂和蔗糖濃度，可以降低玻璃化率;當6-BA 濃度超過2.0 mg/L、光照低于2 000 lx、培養(yǎng)瓶內(nèi)濕度較大時，玻璃化率明顯提高。培養(yǎng)基的種類和激素的使用濃度是引起花楸組織培養(yǎng)玻璃化的2 個主要原因［13］。光照時數(shù)少于8 h，光照強度低于1 000 lx 時，容易引起洋桔梗玻璃化［14］。為了防止觀賞羽扇豆組培中玻璃化現(xiàn)象，我們采取了調(diào)整蔗糖濃度、瓊脂濃度、培養(yǎng)溫度和光照時間等措施，結(jié)果表明，選取蔗糖濃度30 g/L、瓊脂濃度6 g/L、培養(yǎng)溫度20 ℃和光照時間14 h，可明顯抑制玻璃化現(xiàn)象。也有研究表明，在培養(yǎng)基中附加活性炭［15］、赤霉素［16］、青霉素［17］、多效唑［18］等措施均可有效減輕或防治玻璃化。本試驗沒有進行添加附加物這方面的探討，今后將逐步進行深入研究。

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