維藥肉桂子體外抗氧化活性研究

胡曙晨，馬雪紅，李新霞，李 莉，熱娜·卡斯木，支 玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011)

肉桂子(Fructus cinnamomi cassiae immaturi)系樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia presl)的干燥帶宿萼的未成熟果實［1］。肉桂子以全粒入藥，是維吾爾醫(yī)習(xí)用的藥材，用于治療濕寒性或黏液質(zhì)性心臟和腸胃疾病，在新疆各地的維吾爾醫(yī)院有長期的應(yīng)用歷史。肉桂子亦可作為成方制劑用于治療男性前列腺炎、腎炎、缺血性心腦血管疾病、腸胃疾病，還可用來預(yù)防家禽瘟疫。

自由基學(xué)說是20世紀50年代中期由著名學(xué)者Harman首先提出，是具有代表性的致衰學(xué)說之一［2］。自由基能夠獨立存在，在機體內(nèi)有很強的氧化反應(yīng)能力，是機體正常代謝的中間產(chǎn)物，易產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，對蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等產(chǎn)生傷害作用，從而導(dǎo)致機體損傷［3］。近年隨著對自由基研究的深入，人體內(nèi)自由基被認為是引發(fā)癌變、衰老和細胞損傷的重要原因，因而具有清除自由基能力的天然抗氧化劑也越來越受到眾多學(xué)者的親睞。迄今為止，用于評價植物抗氧化能力的方法有很多，如硫氰酸鹽法、硫代巴比妥酸法、抗氧化能力指數(shù)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、高效液相色譜法等，還有很多清除自由基的檢測評價方法，這些方法都各有利弊。目前常用于評價抗氧化活性的方法有1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)法，羥基自由基(·OH)法。

國內(nèi)對于肉桂子藥理活性方面的研究較少，趙晨等使用DPPH方法和脂質(zhì)過氧化方法檢測了肉桂子、花椒揮發(fā)油的抗氧化活性，通過和陽性對照維生素E和維生素C的比較，發(fā)現(xiàn)兩種植物揮發(fā)油均有不同程度的抗氧化活性，花椒的抗脂質(zhì)過氧化活性和清除自由基活性均強于肉桂子［4］。

本文以紫外可見分光光度法對維藥肉桂子提取物進行抗氧化能力測定，初步評價其抗氧化活性，以期為其藥用價值的開發(fā)和發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料:維藥肉桂子四批次(分別購買于廣西桂林，越南，和田和伊犁漢人街市場)。

試劑:DPPH(Solarbio，Cat No.D0909)，維生素C(國藥集團新疆制藥有限公司)，鄰二氮菲(天津市光復(fù)精細化工研究所)，磷酸、磷酸氫二鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)，雙氧水、無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)，硫酸亞鐵、甲醇(天津市福晨化學(xué)試劑有限公司)，雙蒸水。

儀器:紫外可見分光光度計(UV-2550，JAPAN);超聲波清洗儀(500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司);高速萬能粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);分析天平(Mettler-Teledo，AB135-S，d=0.01/0.1 mg);分析天平(BL150，北京賽利多斯);電熱恒溫水浴鍋(DK-S24型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 稱取肉桂子粉末2.5 ～5.0 g，置于100 mL 錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲30 min，過濾，定容至100 mL容量瓶，作為供試品溶液備用。

1.2.2 肉桂子提取物對 DPPH 清除率的測定［5－6］

(1)DPPH溶液穩(wěn)定性實驗:DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，在517 nm附近有強吸收，當DPPH·溶液中加入自由基清除劑時，孤對電子被配對，顏色由紫色向黃色變化，在517 nm處的吸光度變小，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系，可用清除率(Inhibition percent，IP)表示，IP值越大，抗氧化能力越強。

研究DPPH自由基測定體系在肉桂子提取物作用下吸光度(A)隨時間的變化規(guī)律，結(jié)果見圖1。加入肉桂子提取物溶液(0.025 g·mL－1)后，測定吸光度A與時間的關(guān)系，由圖可看出:A值在最初的5 min內(nèi)下降較快;在10～15 min內(nèi)，反應(yīng)體系A(chǔ)值變化趨于平緩;10 min后A值相對穩(wěn)定。故測定時選擇DPPH與肉桂子提取物反應(yīng)時間為10 min。

圖1 肉桂子提取物與DPPH反應(yīng)吸光度時間曲線

(2)肉桂子提取物清除DPPH活性測定:分別配置系列濃度供試品溶液，分別吸取(0.08 g·mL－1)DPPH甲醇溶液2 mL，各加肉桂子系列溶液1 mL于同一具塞試管，搖勻，在黑暗中放置10 min，在516 nm處測定吸光度Ai;以1 mL甲醇代替1 mL樣品溶液測得吸光度值A(chǔ)0;以2 mL甲醇代替2 mL DPPH甲醇溶液則測得吸光度值A(chǔ)j。按照公式計算清除率。

清除率S(%)=1－(Ai－Aj)/A0×100%

A0—DPPH與試樣溶劑混合后的吸光度;Ai—DPPH與供試品溶液反應(yīng)后的吸光度;Aj—樣品與溶劑的空白吸光度。

取0.08 g·L－1濃度的DPPH溶液，以甲醇為空白，測定其在200～800 nm全波長的吸光度A0(注:當測定不同濃肉桂子提取液時，該步驟須重復(fù))。再取各濃度肉桂子提取液，測其在全波長最大吸光波長處的吸光度Aj。而后取各濃度肉桂子提取液1 mL及濃度為0.08 g·L－1的DPPH溶液2 mL先后加入同一具塞試管，搖勻，在黑暗中放置10 min，測其在全波長最大吸光波長處的吸光度Ai。每組實驗均平行三次記均值。

測定結(jié)果見表1～5，清除率趨勢見圖2。

表1 廣西批次肉桂子提取物清除DPPH活性測定結(jié)果

表2 和田市場批次肉桂子提取物清除DPPH活性測定結(jié)果

表3 伊犁漢人街批次肉桂子提取物清除DPPH活性測定結(jié)果

表4 越南批次肉桂子提取物清除DPPH活性測定結(jié)果

表5 VC清除DPPH活性測定結(jié)果

圖2 四批肉桂子提取液DPPH清除率趨勢

(3)Vc對DPPH自由基清除率的測定［7］:以甲醇為溶劑，將 Vc 配成0.01，0.03，0.05，0.07，0.09，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol·L－1的溶液，按照(2)的方法測定其抗氧化能力，測定結(jié)果見表5，清除率趨勢見圖3。

圖3 Vc對DPPH清除率趨勢

由以上實驗可知(1)通過肉桂子提取物清除DPPH活性測定法，當廣西肉桂子提取物的濃度50 g·L－1，和田市場肉桂子提取物的濃度100 g·L－1，伊犁漢人街肉桂子提取物的濃度25 g·L－1，越南肉桂子提取物的濃度25 g·L－1時，其抗氧化活性都趨近最大，清除率分別達到95%，95.2%，96.5%和96.0%。而 Vc濃度為 0.088 g·L－1時，其抗氧化活性趨近最大值，清除率達到95.95%，IC50=0.012 g·L－1。(2)廣西肉桂子提取物質(zhì)量濃度為3.0 g·L－1時的清除率，和田市場肉桂子提取物質(zhì)量濃度為1.0 g·L－1時的清除率，伊犁漢人街肉桂子提取物質(zhì)量濃度為3.0 g·L－1時的清除率，越南肉桂子提取物質(zhì)量濃度為3.0 g·L－1時的清除率與Vc質(zhì)量濃度為0.035 g·L－1相當。(3)肉桂子提取物對DPPH的清除率表明其抗氧化能力為越南批次＜伊犁漢人街批次＜廣西批次＜和田市場批次。

1.2.3 肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定［8］取1 mL 濃度為0.75 mmol·L－1的鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，依次加入2 mL濃度為 0.2 mol·L－1的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.40)和1 mL蒸餾水，充分混勻后，加入1 mL濃度為0.75 mmol·L－1的硫酸亞鐵溶液(FeSO4)混勻，再加入1 mL濃度為0.01%的雙氧水(H2O2)，于37℃水浴60 min，在510 nm處測其吸光值，所測得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光值(A(損));以1 mL樣品液代替1 mL蒸餾水則測得樣品的吸光值(A(樣));用1 mL蒸餾水代替1 mL雙氧水測得的吸光值為A(未)。重復(fù)3次。清除率按下式計算:清除率(%)=［(A(樣)-A(損))/(A(未)-A(損)］×100%取不同批次的肉桂子分別配置為不同系列濃度，按上述方法依次測定吸光度。

測定結(jié)果見表6～9，清除率趨勢見圖4。

表6 伊犁漢人街肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定結(jié)果

表7 和田市場肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除能力測定結(jié)果

表8 廣西肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定結(jié)果

表9 越南肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定結(jié)果

圖4 四批肉桂子提取液(·OH)清除率趨勢

由以上實驗可知，肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除率能力表明其抗氧化能力為越南批次＜伊犁漢人街批次＜和田市場批次＜廣西批次。

2 討論

在肉桂子提取物DPPH清除率實驗中，要注意在加入藥材粉末之前，將全部儀器洗凈備用，如有雜質(zhì)存在會影響DPPH在紫外可見分光光度計的吸光度的測定，使實驗失敗。在肉桂子提取物對羥基自由基(·OH)清除能力的測定中，要注意在測定過程中使溶液在水浴鍋中37℃加熱60 min，時間不能縮短，一旦縮短會影響吸光度的測定。

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