穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ABCG2 shRNA真核沉默載體的人喉癌Hep-2細(xì)胞的建立及其SP檢測

仇飛飛，萬光倫，陳召靈，呂秋萍

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，安徽合肥 230001)

喉癌(Laryngeal Carcinoma)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，它的預(yù)后較差。該病主要發(fā)生在濫用煙酒的成年男性，其特點是鱗狀分化。喉癌通常發(fā)現(xiàn)時患者已經(jīng)是晚期，這導(dǎo)致了喉癌的低治療率和高發(fā)生率［1］。

越來越多的證據(jù)表明，大量具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞有不同的生物學(xué)特性［2］。在這些細(xì)胞中，有一個小族群的細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞(CSCs)，它導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［3］。腫瘤干細(xì)胞是一類具有永生或無限自我更新能力的細(xì)胞，它們的數(shù)目相對恒定，有強(qiáng)的遷徙、浸潤、轉(zhuǎn)移能力;具有多分化潛能，能分化為不同表型的腫瘤細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞可以通過一系列獨特的細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD133、CD24等進(jìn)行分離。在腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表型(細(xì)胞表面標(biāo)志)未知的情況下，側(cè)群細(xì)胞(side population SP)分選被認(rèn)為從各種組織和細(xì)胞系中分選具有干細(xì)胞潛能的起始細(xì)胞的一種有效的方法［4］。研究認(rèn)為產(chǎn)生SP表型是由于位于細(xì)胞膜上的ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白高表達(dá)，SP分離是基于細(xì)胞通過增加ABCG2的表達(dá)來外排Hoechst 33342染料的能力。目前，我們已用喉癌細(xì)胞系Hep-2進(jìn)行了ABCG2的初步探索，ABCG2在SP細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高。因而本實驗利用shRNA特異性沉默ABCG2基因的表達(dá)，研究沉默ABCG2后，對Hep-2細(xì)胞的SP細(xì)胞的影響影響，為人喉癌的研究提供有價值的資料。

1 材料與方法

1.1 材料 人喉Hep-2細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫;ABCG2 shRNA真核表達(dá)載體購自O(shè)RIGENE，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為 Invitrogen公司產(chǎn)品，MTT相關(guān)試劑為Sigma公司。嘌呤霉素購自Merck。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2細(xì)胞用含1%抗生素，10%小牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基放在37℃ 、5%CO2，條件下培養(yǎng)。

1.2.2 沉默目的基因的質(zhì)粒載體對Hep-2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (1)Hep-2細(xì)胞分為3組，Sh-ABCG2組為轉(zhuǎn)染目的基因質(zhì)粒，Sh-Con為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，Control為空白對照，接種于六孔板中，37℃ 、5%CO2，條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右。

(2)轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照lipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。

(3)嘌呤霉素篩選，2周時觀察細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度為最佳篩選濃度，維持使用篩選濃度的一半，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)正常且表達(dá)較強(qiáng)綠色熒光蛋白時分離陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，用以檢測ABCG2mRNA和蛋白的表達(dá)。

1.2.3 RT-PCR 檢測方法 TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照引物設(shè)計原則設(shè)計PCR引物，ABCG2的上、下游引物序列分別為5’-GGGTTCTCTTCTTCCTGACGACC-3’，5’-TGGTTGTGAGATTGACCAACAGACC-3’。擴(kuò)增片段長度399bp，GAPDH上、下游引物序列分別為:5’-TGGCCAAGGTCATCCATGACAACT-3’，5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAGA-3’，擴(kuò)增片段長度100bp。PCR反應(yīng)結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照成像，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 蛋白質(zhì)印記法(Western-blot) 在細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白。取40 μg蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜。洗膜5次，每次5 min。加入稀釋一抗(ABCG2按1∶500稀釋，GAPDH按1∶1 000稀釋)，4℃溫育過夜。洗膜5次，每次5 min。加入1∶1 000倍稀釋的二抗，搖床37℃溫育2 h。溫育結(jié)束后，曝光成像。

1.2.5 SP細(xì)胞的檢測 (1)分選使用的試劑配制:Hoechst33342按1 g·L－1配成原液，維拉帕米按0.5 g·mL－1配成原液，－20℃保存?zhèn)溆?。PI配制成20 mg·L－1的原液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)各組細(xì)胞SP檢測的步驟:取對數(shù)期生長的各組細(xì)胞，制成濃度為1×109·L－1的單細(xì)胞懸液。檢測時每管加入細(xì)胞懸液 0.8 mL，加入 Hoechst33342至終濃度為5 mg·L－1;各組對照組加入維拉帕米至終濃度為 150 μmol·L－1，孵育30 min后，在加Hoechst33342至終濃度為5 mg·L－1。檢測前20 min加入PI至終濃度為1 mg·L－1。流式細(xì)胞儀上檢測SP比例。

(3)SP檢測的各組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)SPSS軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)ABCG2 shRNA轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞有綠色熒光 熒光顯微鏡下檢測，可以清楚看到熒光表達(dá)如圖1，Sh-ABCG2組轉(zhuǎn)染后的 Hep-2細(xì)胞形態(tài)清楚，在明暗場的對比下，可以看到暗場有綠色熒光，Sh-Con組轉(zhuǎn)染后在暗場綠色熒光，只有Control組在轉(zhuǎn)染后的暗場沒有綠色熒光，表明Sh-ABCG2沉默載體和對照Sh-Con載體已成功轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中。

圖1 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep-2細(xì)胞(×200)

2.2 嘌呤霉素的篩選濃度 細(xì)胞培養(yǎng)2周時觀察到最佳篩選濃度確定為1.0 mg·L－1，維持濃度為0.5 mg·L－1。

2.3 ABCG2在mRNA水平的沉默 Hep-2細(xì)胞克隆中的ABCG2 mRNA的表達(dá)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞所提RNA均能擴(kuò)增出GAPDH條帶，如圖2A中1(Sh-Con)，2(Sh-ABCG2)所示;Sh-Con組的Hep-2細(xì)胞所提RNA能擴(kuò)增出目的ABCG2基因，如圖2B中1號條帶;Sh-ABCG2組不能擴(kuò)增目的ABCG2基因，如圖2B中的2號條帶;提示ABCG2基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-ABCG2的Hep-2細(xì)胞中mRNA水平得到了沉默。

圖2 RT-PCR檢測ABCG2的表達(dá)

2.4 ABCG2在蛋白水平的沉默 Hep-2細(xì)胞克隆中ABCG2蛋白的表達(dá)，經(jīng)Western blot檢測，結(jié)果如圖3所示，Sh-ABCG2組所提蛋白中沒有ABCG2蛋白表達(dá)，而Sh-Con組和Control組均有ABCG2蛋白表達(dá)，Sh-ABCG2組與Sh-Con組和Control組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。這表明真核沉默載體已在真核細(xì)胞Hep-2的蛋白水平內(nèi)得到了沉默。

圖3 Western-blot檢測ABCG2蛋白表達(dá)。

2.5 SP檢測示Sh-ABCG2組轉(zhuǎn)染后的SP細(xì)胞比例較其他組細(xì)胞明顯降低 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞在經(jīng)Hoechst33342染色后，以及通過加維拉帕米來抑制SP細(xì)胞外排Hoechst33342染料，得到如下的結(jié)果:Sh-ABCG2組的細(xì)胞在加維拉帕米后SP細(xì)胞比例為(0 ±0.07)%，對照組為(0.3 ±0.10)%，Sh-Con組的細(xì)胞在加維拉帕米后SP細(xì)胞比例為(0.4±0.13)%，對照組為(2.9 ±0.27)%。Control組的細(xì)胞在加維拉帕米后 SP細(xì)胞比例為(0.2±0.08)%，對照組為(3.3 ±0.35)%，Sh-ABCG2 組較Sh-Con組和Control組的SP細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測各組SP細(xì)胞

3 討論

ABC(三磷酸腺苷結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運蛋白，有如ABCB1，P糖蛋白，ABCG2等，他們運輸細(xì)胞中各種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的化合物［5］。ABCG2被稱為半轉(zhuǎn)運蛋白，位于胞漿［6］，ABC轉(zhuǎn)運蛋白由全轉(zhuǎn)運子或半轉(zhuǎn)運子組成.全轉(zhuǎn)運子含有12個跨膜區(qū)(Membrane spanning domain.MSD)，和2個核苷酸結(jié)合區(qū)(Nucleotide binding domains，NBD)，而半轉(zhuǎn)運子只含 6個MSD和1個NBD，這些轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用必須條件是組成同型或異性二聚體，目前這種功能二聚體局限于內(nèi)膜［7］。ABCG2能從細(xì)胞轉(zhuǎn)運出一些抗癌劑如伊立替康，SN-38，伊馬替尼，甲氨蝶呤，米托蒽酮［8］。由于同源二聚體發(fā)揮作用，ABCG2的抗性在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時得到穩(wěn)定遺傳。ABCG2在正常組織和腫瘤中都有表達(dá)，在機(jī)體內(nèi)可維持干細(xì)胞的穩(wěn)定性和組織細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞低氧狀態(tài)，參與腫瘤干細(xì)胞多抗藥的形成;在腫瘤干細(xì)胞中，ABCG2可以導(dǎo)致干細(xì)胞增殖和自我更新，阻礙干細(xì)胞分化。

ABCG2在胎盤，血腦屏障，胃腸道、肝，腎、睪丸、哺乳期的乳房中廣泛表達(dá)［9］。ABCG2位于小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞［10］，肝癌細(xì)胞的表面［11］和腎小管腔的表面［12］，實驗性抑制ABCG2的活動影響藥物在體內(nèi)的分布［13－14］。在健康志愿者中觀察到ABCG2的表達(dá)沒有性別差異［15］。隨后，免疫組化兩種不同的特異ABCG2抗體BXP-21和BXP-34檢測到ABCG2在小腸和結(jié)腸的上皮，胎盤合胞體滋養(yǎng)層，肝微管膜，乳腺導(dǎo)管和小葉，靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮高表達(dá)，ABCG2在不同的非惡性轉(zhuǎn)移組織(包括小腸，肝臟，腎臟，睪丸，胎盤，血腦屏障)的定位和蛋白表達(dá)，揭示了ABCG2的藥物吸收、分布和排泄規(guī)律［16］。Diestra使用單克隆抗體 BXP-21，檢測到ABCG2在所研究的21種腫瘤中的表達(dá)，但在消化道(如大腸、食管、胃)、子宮內(nèi)膜和肺相關(guān)的腫瘤以及黑素瘤表達(dá)最強(qiáng)［17］。同時也在急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。Shen等在98例LSCC樣本中發(fā)現(xiàn)ABCG2的表達(dá)率為52.0%，而且ABCG2的表達(dá)與其臨床階段，淋巴轉(zhuǎn)移以及總體生存率有重要關(guān)系。ABCG2與her-2的表達(dá)、浸潤性乳腺導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床階段有關(guān)［18］，甚至是乳腺癌惡性進(jìn)展的預(yù)兆及一個獨立預(yù)后因素［19］。在喉癌中，ABCG2也是高表達(dá)，本實驗前期已有研究人員發(fā)現(xiàn)ABCG2在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)。Chen等基于RNA干擾方法的研究表明一直ABCG2可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外，可以通過fumitremorgin C、化學(xué)抑制劑阻礙ABCG2的功能，也通過長時間抑制細(xì)胞增殖G0/G1間隔［20］。這些數(shù)據(jù)表明，ABCG2可能導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和自我更新。但是在喉癌Hep-2細(xì)胞中ABCG2的作用還不清楚。

本實驗前期的研究發(fā)現(xiàn)，在喉癌Hep-2細(xì)胞中的SP，NSP以及喉癌Hep-2細(xì)胞中，ABCG2在各組細(xì)胞中的表達(dá) ABCG2在SP細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，SP與Hep-2及non-SP間CD133的表達(dá)具有顯著性差異(F=21.27，P=0.019)。因此，在喉癌Hep-2細(xì)胞中，ABCG2可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤干細(xì)胞的自我更新。

本研究用lip2000將ABCG2 shRNA轉(zhuǎn)染到喉癌Hep-2細(xì)胞中，熒光顯微鏡的觀察轉(zhuǎn)染效果，經(jīng)過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;RT-PCR和Western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株ABCG2的沉默效果;Hep-2細(xì)胞和 Hep-2-shABCG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng) Hoechst33342染色，流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞比例。綜合檢測結(jié)果，得到如下初步結(jié)論:(1)建立ABCG2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人喉癌Hep-2細(xì)胞株;(2)ABCG2基因表達(dá)與SP細(xì)胞比例密切相關(guān)。為喉癌和SP細(xì)胞的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

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