枸地氯雷他定抗過(guò)敏性炎癥作用實(shí)驗(yàn)研究

何廣衛(wèi)，儲(chǔ)昭興，李家明

(1.合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽合肥 230601;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032)

過(guò)敏性疾病為臨床常見(jiàn)病，現(xiàn)已成為世界上幾乎所有國(guó)家的主要健康問(wèn)題，被稱(chēng)為21世紀(jì)的疾?。?］。其發(fā)病機(jī)制主要涉及I型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，組胺是引起過(guò)敏發(fā)生的最主要介質(zhì)，其次為白三烯、前列腺素和白介素等。研究表明過(guò)敏性疾病后期多伴隨炎癥，如IL-5、TNF-α在哮喘和/或鼻炎的致病中發(fā)揮著重要作用［2］;IL-4、IL-10等炎癥因子等參與過(guò)敏性哮喘的發(fā)病機(jī)制［3］;組胺與過(guò)敏性紫癜的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［4］，也是I型過(guò)敏反應(yīng)中最為重要的生物活性物質(zhì)［5］;而PGE2和LTB4作為免疫細(xì)胞釋放的重要炎癥介質(zhì)，還具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能［6］。枸地氯雷他定(8-氯-6，11-二氫-11-(4-亞哌啶基)-5H-苯并［5－6］環(huán)庚［1，2-b］吡啶枸櫞酸氫二鈉鹽二水合物)為新一代組胺H1受體拮抗劑，臨床抗過(guò)敏療效確切、毒副作用小，本文主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)初步考察其對(duì)過(guò)敏后續(xù)的炎癥反應(yīng)的影響作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 枸地氯雷他定(南京海辰藥業(yè)有限公司，批號(hào):20121001)、依巴斯汀(武漢嘉凱隆科技發(fā)展有限公司批號(hào):20111002)、鹽酸左西替利嗪(武漢嘉凱隆科技發(fā)展有限公司，批號(hào):20120722)、地塞米松注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):1301251)，臨用前均用1640細(xì)胞培養(yǎng)液溶解至所需濃度;RPMI1640培養(yǎng)液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào):20121228);類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清FCS(民海生物工程有限公司，批號(hào):120618);卵蛋白OVA(Sigma公司，批號(hào):A5253);PGE2及 LTB4ELISA試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào):KGEM051，KGEM041);TNF-α、IL-4、IL-5 及 LTB4ELISA試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號(hào):EK0527，EK0405，EK0408)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，雌雄各半，5～6周齡，體重(20±2)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供［合格證號(hào):SYXK(浙)2008－0033］。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 恒溫培養(yǎng)箱N(xiāo)UAIR-NU-5510E(上海凌儀實(shí)業(yè)有限公司);生物安全柜BSC1300(上海博迅);酶標(biāo)儀Spectramax M2e(美國(guó)Molecular Devices公司);倒置顯微鏡DMI3000B(德國(guó)Leica公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法［7］

1.4.1 致敏小鼠模型的構(gòu)建及脾淋巴細(xì)胞的分離實(shí)驗(yàn)第1天于小鼠腹腔注射含卵蛋白(OVA)100 μg及氫氧化鋁4 mg的0.9%NaCl注射液0.2 mL，第15天再次腹腔注射0.2 mL 0.9%NaCl注射液(含OVA 100 μg)構(gòu)建OVA致敏的小鼠模型，第2次注射24 h后小鼠斷頸放血。小鼠于75%酒精內(nèi)浸泡3 min，無(wú)菌條件下取小鼠脾臟，手術(shù)剪剪碎后加50倍量0.5%胰酶，于37℃振蕩消化15 min，過(guò)200目濾網(wǎng)，制備脾細(xì)胞懸液。用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞為2×106mL－1，加于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1.5 mL。加各待測(cè)藥物前于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置12 h，待淋巴細(xì)胞沉于底部后，小心移去培養(yǎng)液，重新加新鮮培養(yǎng)液1 mL。

1.4.2 各待測(cè)藥物對(duì)小鼠致敏脾淋巴細(xì)胞的預(yù)處理 枸地氯雷他定、鹽酸左西替利嗪及地塞米松注射液用1640細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)稀釋至所需濃度，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)除菌，依巴斯汀加DMSO助溶后稀釋至所需濃度。枸地氯雷他定、依巴斯汀、鹽酸左西替利嗪在各組淋巴細(xì)胞懸液中的終濃度分別為 0.15、1.5、15 μmol·L－1，地塞米松為1.5 μmol·L－1，DMSO 最終濃度 0.1%，共12 組，每組3個(gè)復(fù)孔。各組藥物預(yù)處理后，加OVA(終濃度分別為200 mg·L－1)進(jìn)行刺激，與37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各炎癥因子釋放水平的檢測(cè) 以各組藥物及OVA預(yù)處理后，孵育2 h，離心，收集培養(yǎng)上清液，以 ELISA法檢測(cè) LTB4及PGE2的水平;孵育9 h后收集培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)TNF-α水平;孵育36 h后收集培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)IL-4及IL-5水平，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)OVA刺激后LTB4、PGE2、IL-4、IL-5及TNF-α的表達(dá) OVA致敏小鼠的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)OVA 再次刺激后，其LTB4、PGE2、IL-4、IL-5及TNF-α水平均高于正常對(duì)照組小鼠(P值均＜0.01)，見(jiàn)表1、表2，提示模型成功。

2.2 藥物預(yù)處理后對(duì) LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及TNF-α釋放的影響 以不同濃度的枸地氯雷他定對(duì)致敏淋巴細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清的 LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 水平均受到不同程度抑制，且其抑制程度隨藥物濃度的增加而增加，說(shuō)明枸地氯雷他定對(duì)致敏小鼠淋巴細(xì)胞釋放LTB4、PGE2、IL-4、IL-5 及 TNF-α 具有抑制效應(yīng)并存在濃度依賴(lài)性。同時(shí)DMSO預(yù)處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清的各炎癥因子與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異，故可排除DMSO對(duì)炎癥因子的非特異性抑制效應(yīng)。

在相同作用濃度下，地塞米松抗炎活性最強(qiáng)，枸地氯雷他定高濃度組可獲得與地塞米松相當(dāng)?shù)幕钚?，與鹽酸左西替利嗪和依巴斯汀相比，對(duì)PGE2釋放的抑制作用枸地氯雷他定＞鹽酸左西替利嗪＞依巴斯汀;對(duì)LTB4釋放的抑制作用鹽酸左西替利嗪＞枸地氯雷他定＞依巴斯汀;對(duì)TNF-α釋放的抑制作用枸地氯雷他定＞鹽酸左西替利嗪及依巴斯汀;三者對(duì)遲發(fā)相炎癥因子IL-4及IL-5的釋放均有顯著抑制作用。見(jiàn)表1、2。

3 討論

過(guò)敏性疾病亦稱(chēng)為變態(tài)反應(yīng)性疾病，主要包括蕁麻疹、過(guò)敏性鼻炎等，國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)資料表明，約有1/3以上的人一生曾患過(guò)敏性疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量、工作和學(xué)習(xí)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8］，其病理生理過(guò)程中有炎癥因子的參與，過(guò)去未對(duì)抗過(guò)敏藥物是否具有抗炎癥活性進(jìn)行明確研究，但在近期的文獻(xiàn)報(bào)道中越來(lái)越多的被涉及到，尤其是針對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病如過(guò)敏炎癥性哮喘等。

研究證明抗過(guò)敏藥物孟魯斯特和地塞米松均可通過(guò)抑制受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)、NF-KB等因子在氣道末梢軟組織的表達(dá)，降低嗜酸性粒細(xì)胞，從而改善OVA誘導(dǎo)的呼吸系統(tǒng)過(guò)敏性炎癥豚鼠癥狀［9］;而阻斷組胺H1受體可抑制骨髓系樹(shù)突細(xì)胞(Bone-marrow Dendritic cells)IL-6和TNF-α表達(dá)，激活H1受體可以誘導(dǎo)TNF-α過(guò)表達(dá)，因此，H1受體已被證實(shí)與過(guò)敏性炎癥有關(guān)［10］。

表1 枸地氯雷他定對(duì)OVA致敏小鼠淋巴細(xì)胞炎癥因子IL-4、IL-5及TNF-α釋放的影響(±s，n=3)

表1 枸地氯雷他定對(duì)OVA致敏小鼠淋巴細(xì)胞炎癥因子IL-4、IL-5及TNF-α釋放的影響(±s，n=3)

注:與正常組比較，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 IL-4/ng·L－1 IL-5/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 32.88 ±8.35 22.40 ±3.86 86.86 ±10.77模型 104.19±20.75△△ 61.72±9.00△△ 306.39±33.08△△△地塞米松/μmol·L －1 1.5 46.71 ±6.70＊＊ 30.50 ±4.03＊＊ 199.70 ±20.57＊＊枸地氯雷他定/μmol·L －1 0.15 76.02 ±12.49 53.37 ±5.52 254.83 ±18.48 1.5 58.96 ±8.04* 45.74 ±5.42 187.76 ±37.88*15 55.73 ±4.67* 33.62 ±3.79＊＊ 183.12 ±28.30＊＊依巴斯汀/μmol·L －1 0.15 95.78 ±4.99 55.62 ±7.23 294.59 ±42.25 1.5 71.56 ±9.67 38.78 ±3.82* 264.23 ±51.58 15 51.56 ±6.00* 34.89 ±5.26＊＊ 247.71 ±43.28鹽酸左西替利嗪/μmol·L－1 0.15 96.26 ±8.58 49.56 ±5.78 270.61 ±40.19 1.5 59.56 ±5.45* 44.51 ±3.15* 239.29 ±26.17 15 55.44 ±7.49* 40.04 ±5.94*正常244.68 ±44.48

表2 枸地氯雷他定對(duì)OVA致敏小鼠淋巴細(xì)胞炎癥因子PGE2及LTB4釋放的影響(±s，n=3)

表2 枸地氯雷他定對(duì)OVA致敏小鼠淋巴細(xì)胞炎癥因子PGE2及LTB4釋放的影響(±s，n=3)

注:與正常組比較，△△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 PGE2/ng·L－1 LTB4/ng·L －1 51.02 ±10.85 43.23 ±8.48模型 214.35 ±36.56△△ 178.93 ±41.99△△地塞米松 1.5 μmol·L－1 77.27 ±20.84＊＊ 57.72 ±5.61＊＊枸地氯雷他定/μmol·L －1 0.15 144.65 ±14.64* 128.70 ±12.40 1.5 124.50 ±18.73* 112.8 ±15.06 15 82.00 ±15.29＊＊ 94.08 ±11.20*依巴斯汀/μmol·L－1 0.15 199.63 ±16.31 163.31 ±20.46 1.5 179.60 ±18.46 148.18 ±14.79 15 161.46 ±16.21 108.45 ±13.80*鹽酸左西替利嗪/μmol·L －1 0.15 185.34 ±17.43 124.18 ±14.79 1.5 159.60 ±22.88 106.34 ±15.60*15 130.61 ±13.14* 76.84 ±15.27正常*

枸地氯雷他定為H1受體拮抗劑，臨床應(yīng)用于急慢性蕁麻疹、過(guò)敏性鼻炎等疾病，具有顯著療效，口服吸收快，起效時(shí)間短，半衰期長(zhǎng)，作用持久且副作用較小，其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用發(fā)生率較低，主要為口干和嗜睡現(xiàn)象發(fā)生［11］。最新研究發(fā)現(xiàn)，枸地氯雷他定臨床上對(duì)老年性皮膚瘙癢［12］和面部皮炎［13］等炎癥相關(guān)性疾病有顯著治療作用。

本文主要通過(guò)小鼠腹腔注射卵蛋白聯(lián)合氫氧化鋁膠體構(gòu)建致敏動(dòng)物模型，分離并培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞，考察枸地氯雷他定對(duì) LTB4、PGE2、IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥相關(guān)因子的影響，探討枸地氯雷他定體外抗過(guò)敏性炎癥活性，并與依巴斯汀、鹽酸左西替利嗪等同類(lèi)藥進(jìn)行比較，為深入研究及證明枸地氯雷他定具有抗炎療效提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枸地氯雷他定不僅具有顯著的體外抗炎癥活性，在高濃度下還可獲得與地塞米松相當(dāng)?shù)囊种菩Ч?。與鹽酸左西替利嗪和依巴斯汀同類(lèi)藥物相比較，枸地氯雷他定更具備早期抗炎癥的潛力。

對(duì)于枸地氯雷他定的抗過(guò)敏性炎癥作用，還需在更多炎癥模型上進(jìn)一步驗(yàn)證，并闡明其與RANTES、NF-KB等因子的相互作用機(jī)制關(guān)系，但本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證明其有在過(guò)敏性炎癥疾病，尤其是氣道過(guò)敏性炎癥疾病方面有應(yīng)用潛力。

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