前列腺增生癥中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C的表達(dá)與血清前列腺特異抗原的相關(guān)性

辛玉宏 ，賴建生，趙國(guó)平，肖寧新，鄭東升，陳 虎，張 艷，張 慧，劉春曉

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬江門醫(yī)院：1.泌尿外科；2.病理科；3.圖書(shū)館，廣東江門 529000；4.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科，廣東廣州 510280）

前列腺增生癥（benign prostatic hyperplasia，BPH）是老年男性常見(jiàn)的疾病之一，目前血清前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）是最常用的前列腺腫瘤指標(biāo)，對(duì)術(shù)前預(yù)測(cè)前列腺性質(zhì)起到重要作用，但近年P(guān)SA 的此作用逐漸被質(zhì)疑，學(xué)界存在不同的意見(jiàn)。在前列腺增生的過(guò)程中，已有多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（vascular endothelial growth factor，VEGF－C）可能通過(guò)誘導(dǎo)前列腺血管及淋巴管內(nèi)皮的增生［1］，促進(jìn)前列腺增生，而VEGFC與血清PSA 之間是否有相關(guān)性，本研究試圖對(duì)此進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集本院2011年6月至2013年6月術(shù)后確診為BPH 的患者150 例，術(shù)前測(cè)定血清PSA 值，采血前均未服用5α還原酶抑制劑，未行前列腺指檢，無(wú)急性泌尿系感染，未留置尿管，所有患者均使用相同的等離子電切系統(tǒng)（Olympus）行經(jīng)尿道前列腺雙極汽化電切術(shù)，術(shù)中保持有效功率的低值，避免長(zhǎng)時(shí)間電凝，尤其是切割前列腺尖部組織，避免組織過(guò)度汽化損傷括約肌，術(shù)后獲取前列腺組織。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象根據(jù)術(shù)前血清總PSA（total PSA，tPSA）及PSA 比值（f／t）分為5 組：Ⅰ組tPSA＜2.5 ng／mL，Ⅱ組2.5≤tPSA≤4ng／mL，Ⅲ組4＜tPSA≤10ng／mL 且f／t＞0.16，Ⅳ組4＜tPSA≤10ng／mL且f／t≤0.16，Ⅴ組10＜tPSA＜20ng／mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 主要試劑兔抗人VEGF－C 多克隆抗體、DAB粉劑，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ElivisionTMPlus檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 采用ElivisionTMPlus 二步法制作病理玻片。前列腺組織甲醛固定，石蠟包埋，3.5μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟入水，PBS液（pH7.4）浸泡，放入含有抗原修復(fù)液的高壓鍋內(nèi)進(jìn)行熱修復(fù)，自然冷卻至室溫，放入3%（體積分?jǐn)?shù)）過(guò)氧化氫溶液浸泡，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加一抗工作液，室溫下孵育60 min，PBS 液浸泡，滴加聚合物增強(qiáng)劑工作液（試劑A），室溫孵育20min，滴加酶標(biāo)抗鼠／兔聚合物工作液（試劑B），室溫孵育30 min，PBS 液浸泡，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察染色程度，蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌標(biāo)本作為VEGF－C陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 制作好的病理玻片由病理科2位醫(yī)生閱片，判定標(biāo)準(zhǔn)以細(xì)胞核不染色、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)200倍光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)含腺體的視野，觀察前列腺腺體上皮細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)分：未見(jiàn)染色為0分，染色細(xì)胞數(shù)1%～5%為1分，6%～10%為2分，11%～15%為3分，16%～20%為4分，20%以上為5分。根據(jù)2位醫(yī)生結(jié)果計(jì)算平均得分，0～1分為陰性，2～3分為弱陽(yáng)性，4分以上為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、單向方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 VEGF－C 在前列 腺組織 中的表達(dá)在150 例BPH 組織中VEGF－C 表達(dá)陰 性率為17.3%（0 分4.0%，1 分13.3%），弱陽(yáng)性率為55.3%（2 分25.3%，3 分30.0%）、陽(yáng)性率 為27.4%（4 分20.7%，5分6.7%，表1）。VEGF－C 主要著色部位為腺體上皮細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃至棕褐色染色，在基底細(xì)胞表達(dá)較弱（圖1）。

表1 VEGF－C在前列腺組織中的表達(dá) （例）

圖1 前列腺增生組織中VEGF－C的表達(dá)（SP，×200）

2.2 VEGF－C 的表達(dá)水 平與年齡、前列腺體積、tPSA、PSA密度的關(guān)系 首先采用Levene檢驗(yàn)各因素方差齊性，年齡及前列腺體積因素方差具有齊性，tPSA 及PSA 密度方差不齊。方差齊性采用單向方差分析，不同VEGF－C 表達(dá)水平組中年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2.166，P＞0.05），采用Spearman 相關(guān)分析，表明VEGF－C 的表達(dá)水平與年齡無(wú)關(guān)（r＝0.121，P＞0.05）。同法比 較前列 腺體積，不 同VEGF－C表達(dá)水平組中前列腺體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.365，P＜0.01），表明VEGF－C 的表達(dá)水平與前列腺體積呈弱正相關(guān)關(guān)系，VEGF－C的表達(dá)強(qiáng)度越高，前列腺體積越大。方差不齊采用近似方差分析（Welch法及Brown－Forsythe法），不同VEGF－C 表達(dá)水平組中血清總PSA 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.693，P＜0.01），表明VEGF－C 的表達(dá)水平與血清總PSA 呈較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度越高，血清總PSA 越高。同法比較PSA 密度，不同VEGF－C表達(dá)水平組中PSA 密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r＝0.563，P＜0.01），表明VEGF－C 的表達(dá)水平與PSA 密度呈較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度越高，PSA 密度越高（表2）。

表2 VEGF－C表達(dá)水平與年齡、前列腺體積、總PSA、PSA密度的關(guān)系 （）

表2 VEGF－C表達(dá)水平與年齡、前列腺體積、總PSA、PSA密度的關(guān)系 （）

2.3 PSA 分組與年齡、前列腺體積、VEGF－C的關(guān)系不同PSA 組中，年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，除Ⅲ組和Ⅳ組外，余各組前列腺體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。不同PSA 組中，VEGF－C 的表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），其中Ⅰ＋Ⅱ組、Ⅲ＋Ⅳ組及Ⅴ組各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ組和Ⅳ組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在灰區(qū)內(nèi)，Ⅳ組VEGF－C 的表達(dá)水平比Ⅲ組強(qiáng)。不同PSA 組與VEGF－C 的表達(dá)水平呈較強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系。在正常水平PSA 組中，Ⅱ組VEGF－C 的表達(dá)水平比Ⅰ組強(qiáng)（表1、表3）。

表3 各PSA組年齡、前列腺體積、VEGF－C的關(guān)系（）

表3 各PSA組年齡、前列腺體積、VEGF－C的關(guān)系（）

2.4 年齡、前列腺體積與tPSA、PSA 密度、VEGF－C的關(guān)系 患者年齡與前列腺體積正相關(guān)，而與tPSA、PSA 密度、VEGF－C 不相關(guān)，而前列腺體積則與tPSA、VEGF－C正相關(guān)，與PSA 密度無(wú)關(guān)（表4、5）。

表4 年齡與前列腺體積、tPSA、PSA密度、VEGF－C的關(guān)系

表5 前列腺體積與年齡、tPSA、PSA密度、VEGF－C的關(guān)系

3 討論

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，VEGF 在正常前列腺組織中低表達(dá)，在BPH 組織有較高表達(dá)，在前列腺癌組織中有高表達(dá)，3種組織中VEGF 的表達(dá)有顯著性差異，推測(cè)VEGF在前列腺的病理生理方面發(fā)揮著重要作用，它的表達(dá)強(qiáng)度可能預(yù)示著B(niǎo)PH 的發(fā)生發(fā)展以及癌變的趨勢(shì)。因VEGF－C可選擇性誘導(dǎo)淋巴管的增生，故也稱淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。它有兩個(gè)受體，分別表達(dá)于血管和淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，既能誘導(dǎo)血管生成又能誘導(dǎo)淋巴管生成［1］。通過(guò)研究VEGF－C 與微血管密度及淋巴管密度在BPH 及前列腺癌中的表達(dá)，推測(cè)出VEGF－C 可通過(guò)促進(jìn)前列腺組織血管及淋巴管的生成，從而促進(jìn)前列腺細(xì)胞增生及促使細(xì)胞癌變。細(xì)胞的正常及過(guò)度增生均離不開(kāi)血管的供養(yǎng)，有研究表明BPH 組織中結(jié)節(jié)區(qū)微血管密度顯著高于非結(jié)節(jié)區(qū)，兩者均顯著高于正常前列腺組織，BPH 中VEGF－C 表達(dá)強(qiáng)度與微血管密度值之間呈顯著正相關(guān)。另一方面，前列腺癌最常見(jiàn)轉(zhuǎn)移部位為淋巴結(jié)及骨轉(zhuǎn)移，淋巴管的增生對(duì)于細(xì)胞的供養(yǎng)雖不及血管重要，但作為重要的輸出通道，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展尤其轉(zhuǎn)移起了至關(guān)重要的作用。TROJAN等［2］發(fā)現(xiàn)BPH 組織內(nèi)的淋巴管密度高于前列腺癌和正常組織，但多數(shù)學(xué)者研究表明，在同一組織內(nèi)，癌組織淋巴管密度要比BPH 組織及正常組織高，VEGF－C通過(guò)誘導(dǎo)淋巴管密度增加，使腫瘤細(xì)胞有更多機(jī)會(huì)接觸淋巴管，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移［3］。本組數(shù)據(jù)也顯示，VEGF－C的表達(dá)越強(qiáng)，前列腺體積越大。而不少研究指出，在前列腺癌中，VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度比BPH 要高，兩者有顯著性差異，而且VEGF－C 的表達(dá)強(qiáng)度與前列腺癌病理分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系。

VEGF廣泛分布于前列腺癌和前列腺增生組織的腺上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞和血管壁及其周圍組織細(xì)胞。在BPH 組織中主要表達(dá)在腺上皮細(xì)胞，基底細(xì)胞較少，而腫瘤組織間質(zhì)、腺上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均有表達(dá)，以腺上皮細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)。對(duì)于VEGF 的調(diào)節(jié)，RICHARD等［4］發(fā) 現(xiàn)VEGF 的表達(dá) 受雄激 素調(diào)節(jié)。PAREEK等［5］通過(guò)設(shè)計(jì)非那雄胺組和安慰劑組的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)服用非那雄胺組前列腺組織內(nèi)VEGF的表達(dá)下調(diào)。KWAK等［6］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌去勢(shì)治療后的前列腺組織中VEGF 表達(dá)減少。眾所周知，前列腺癌與雄激素有關(guān)，這些研究結(jié)果表明，VEGF的表達(dá)受到雄激素的調(diào)節(jié)，雄激素可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致BPH 的發(fā)展以及前列腺癌的發(fā)生。

隨著診斷水平的提高，前列腺癌發(fā)病率有超越膀胱腫瘤的趨勢(shì)。PSA 作為目前最常用的前列腺腫瘤指標(biāo)，除了在前列腺癌早期診斷及術(shù)后隨訪外，有文獻(xiàn)報(bào)道PSA 作為一種蛋白酶可以活化胰島素樣生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移［7］，而VEGF－C 也被證實(shí)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，兩者之間可能存在某種聯(lián)系。在傳統(tǒng)的觀點(diǎn)里，PSA＜4ng／mL 時(shí)，除非指檢或影像學(xué)檢查有異常，基本可認(rèn)定為良性，但近期國(guó)內(nèi)外較多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在tPSA≤10ng／mL 甚至＜4ng／mL 的情況下，仍有相當(dāng)比例的患者證實(shí)為前列腺癌，美國(guó)國(guó)家癌癥網(wǎng)甚至認(rèn)為當(dāng)tPSA≥2.5ng／mL 時(shí)即應(yīng)進(jìn)行活檢［8］。國(guó)外報(bào)道的tPSA＜4ng／mL的前列腺癌占前列腺癌患者的比例，最高達(dá)25%，平均約為15%，而在tPSA＜2.5ng／mL 的前列腺癌當(dāng)中，有36.4%術(shù)后病理證實(shí)為高級(jí)別的前列腺癌（Gleason 7分或更高）或前列腺癌包膜外侵犯和陽(yáng)性切緣［9］。因此是否應(yīng)該對(duì)tPSA＜4ng／mL 的患者進(jìn)一步細(xì)分？國(guó)內(nèi)張榮華等［10］建議當(dāng)tPSA＜4ng／mL 時(shí)，如果f／tPSA＜0.20，或者PSAD＞0.1，則應(yīng)注意前列腺癌可能。而國(guó)外有學(xué)者研究時(shí)將其分為＜2.5ng／mL 組及2.5≤tPSA≤4ng／mL組，但兩者惡性率分別為13.3%及13.6%，無(wú)顯著差異［11］。SCOTT等［12］通過(guò)回顧36 316例前列腺癌患者的tPSA，得出將tPSA 臨界值設(shè)定為2.5ng／mL比4ng／mL更為準(zhǔn)確。但上述研究對(duì)象均為前列腺癌，暫未見(jiàn)到有研究探討對(duì)BPH 的分組。

BPH 手術(shù)治療僅切除增生的部分或全部腺體，而被切除的腺體位于移行帶，并非前列腺癌多發(fā)生的外周帶，而術(shù)后病理是隨機(jī)選擇小部分組織活檢，以上因素導(dǎo)致病理假陰性的可能。前列腺組織中VEGF－C的表達(dá)水平可作為前列腺術(shù)后復(fù)發(fā)及前列腺增生惡變的預(yù)測(cè)因子，尤其是對(duì)于術(shù)前PSA 異常升高而術(shù)后病理陰性的病例。本研究參照文獻(xiàn)對(duì)于tPSA 分組的新觀點(diǎn)進(jìn)行分組，研究結(jié)果支持目前傳統(tǒng)的tPSA 分組方法，值得注意的是如果按照傳統(tǒng)的VEGF－C表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分，Ⅰ、Ⅱ組間VEGF－C 的表達(dá)并無(wú)顯著性差異，但將評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)細(xì)化后，兩組間出現(xiàn)了顯著性差異，這與目前國(guó)外部分研究的觀點(diǎn)相符合。究竟兩組之間的差異是確實(shí)存在，還是只是一種巧合、Ⅰ、Ⅱ組間VEGF－C的表達(dá)差異有無(wú)實(shí)質(zhì)的意義等問(wèn)題仍需進(jìn)一步研究。

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