CXCL5在膀胱癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

張 凱，管振鋒，丁 晨，朱建寧，杜依青，王新陽，賀大林，范晉海

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061）

據(jù)估計(jì)，2008年全球膀胱癌新增病例386 300例，死亡150 200例，且在世界范圍內(nèi)發(fā)病率差別較大，不同地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率可相差14倍［1］。在美國(guó)，根據(jù)1975～2010年的統(tǒng)計(jì)，男性膀胱癌的發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第4和第7位，膀胱癌嚴(yán)重威脅著人類的健康［2］。

趨化因子是一種重要的小分子細(xì)胞因子，到目前為止，近50種趨化因子得以發(fā)現(xiàn)，成為最大的細(xì)胞因子亞家族。根據(jù)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類：CXC（α）；CC（β）；C（γ）；CX3C（δ）［3］。趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用，趨化因子相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，成為新的生物治療熱點(diǎn)［4］。

在本研究中，我們用免疫組化法研究136例膀胱癌標(biāo)本和30例正常膀胱組織標(biāo)本中CXCL5表達(dá)水平，探討CXCL5的表達(dá)與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科2006年1月至2009年1月間確診為膀胱癌住院手術(shù)（包括膀胱腫瘤電切和膀胱全切）、并有完整臨床和隨訪資料的膀胱癌患者136例，其中男105例，女31例；年齡27～84歲，平均（54.0±0.24）歲。病理診斷均為膀胱移行細(xì)胞癌。患者術(shù)前均未經(jīng)過放療及化療等。正常膀胱組織取自30例膀胱癌全切標(biāo)本，距離癌灶5cm 以上的癌旁膀胱組織視為正常膀胱組織。該研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)情況告知患者并簽署知情同意書。

1.2 腫瘤分級(jí)、分期及隨訪有關(guān)情況 病理分級(jí)按WHO 1973分級(jí)系統(tǒng)。腫瘤分期依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）2003版分期標(biāo)準(zhǔn)，生存時(shí)間的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)按從手術(shù)日到因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡的日期或隨訪日期（2014年2月）為止。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗人CXCL5多克隆抗體（sc－292642），工作濃度1∶200，購(gòu)自Santa Cruz公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒，含山羊抗兔辣根過氧化物酶生物素化二抗，購(gòu)自基因科技（上海）有限公司。

1.4 免疫組織化學(xué)方法 先將切片置于60 ℃烤箱內(nèi)烘烤2h，然后二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，再將切片放入數(shù)控?zé)峥乖迯?fù)儀，121℃維持5min 進(jìn)行抗原修復(fù)，之后阻斷內(nèi)源性過氧化物，用抗體稀釋液按1∶200稀釋兔抗人CXCL5多克隆抗體，每張切片設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照，用PBS 代替一抗。將加好一抗的切片放到濕盒內(nèi)，置于4℃冰箱過夜，再用二抗在室溫下孵育30min，然后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸分化，氨水返藍(lán)，最后用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判斷 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考BEGLEY等［5］的方法，染色強(qiáng)度分級(jí)如下：無著色為0，淡棕黃色為1，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)為：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0，5%～24%為1，25%～49%為2分，≥50%為3分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例評(píng)定陽性表達(dá)：隨機(jī)選取一個(gè)視野后計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，再在每張切片中選取8個(gè)400倍視野，然后計(jì)算陽性細(xì)胞率。目前多采用積分綜合計(jì)量：兩個(gè)得分相乘得到0～9分的總得分，將總得分0～3分組織視為CXCL5表達(dá)陰性，4～6分的組織視為CXCL5表達(dá)弱陽性，7～9 分的組織視為CXCL5 表達(dá)強(qiáng)陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)數(shù)資料分析用χ2檢驗(yàn)，膀胱癌相關(guān)生存期生存分析采用Kaplan－Meier分析法，生存分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Log－Rank檢驗(yàn)判斷差異性。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL5 在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織 免疫組化染色結(jié)果顯示CXCL5在膀胱癌組織和正常膀胱組織的表達(dá)情況（圖1A～1E）。圖1A 為正常膀胱組織樣本，可見有個(gè)別細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有淡黃色顆粒；圖1B為G1級(jí)膀胱癌組織，可見有少量細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有淡黃色顆粒；圖1C 為G2級(jí)膀胱癌組織，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有明顯的棕色顆粒；圖1D 為G3級(jí)膀胱癌組織，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有很明顯的棕褐色顆粒；圖1E為陰性對(duì)照切片。對(duì)趨化因子CXCL5的表達(dá)部位分析，CXCL5主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中，提示CXCL5可能分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用。

圖1 CXCL5在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達(dá)（左下角局部放大圖）

在136例膀胱癌組織和30例正常膀胱組織中，趨化因子CXCL5染色陽性率在膀胱癌組織的表達(dá)率高于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 膀胱癌組織中CXCL5的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān) 在男、女性中，CXCL5陽性表達(dá)率在性別、年齡分組方面差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；在病理分級(jí)、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中，病理分級(jí)、分期高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，CXCL5陽性表達(dá)率較高，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，表2）。

表1 CXCL5的表達(dá)陽性率在正常膀胱組織與膀胱癌組織中的比較 ［例（%）］

表2 CXCL5的陽性表達(dá)率在膀胱癌各分組間的差異 ［例（%）］

2.3 膀胱癌組織中CXCL5的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)截止2014年2月，隨訪患者中最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為59個(gè)月，死亡39例，無瘤存活97例，失訪病例已排除。根據(jù)隨訪資料，Kaplan－Meier生存曲線統(tǒng)計(jì)分析示：CXCL5強(qiáng)陽性表達(dá)組、弱陽性表達(dá)組和陰性組的中位生存期分別為36.0月、51.4月和56.0月；CXCL5強(qiáng)陽性表達(dá)組、弱陽性表達(dá)組和陰性組的5年生存率分別為43.4%、84.5%和100%。CXCL5的陽性表達(dá)與患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān)。其中變量組間的差異分析使用Log－Rank檢驗(yàn)分析，三者之間的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝12.34，P＜0.05，圖2）。

圖2 CXCL5的表達(dá)與膀胱癌5年生存率的關(guān)系

3 討論

CXC趨化因子是一組和腫瘤血管生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子，根據(jù)第一個(gè)半胱氨酸前是否有ELR（谷氨酸－亮氨酸－精氨酸）功能區(qū)分為ELR 趨化因子和非ELR 趨化因子，其中ELR＋趨化因子可使腫瘤血管新生，但非ELR 趨化因子可抑制腫瘤血管生成，而CXCL5屬于ELR 趨化因子［6］。CXCL5可促進(jìn)血管生成，具有很強(qiáng)的粒細(xì)胞趨化作用，由上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞／內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。研究顯示CXCL5可識(shí)別并結(jié)合G 蛋白偶聯(lián)受體CXCR2，對(duì)腫瘤的形成和進(jìn)展發(fā)揮重要作用［7－8］。

血管生長(zhǎng)在腫瘤發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，是腫瘤生長(zhǎng)的基礎(chǔ)［9］。實(shí)驗(yàn)研究表明抑制腫瘤血管生成可明顯影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及進(jìn)展［10］。白細(xì)胞介素－17 可明顯增強(qiáng)趨化因子CXCL1、5、8在腫瘤血管生成的活力，通過增加腫瘤的微血管密度來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)［11］。腫瘤細(xì)胞可與宿主的特異性趨化因子受體結(jié)合進(jìn)而獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，研究發(fā)現(xiàn)肝、肺等靶器官的特異性轉(zhuǎn)移與淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，可能通過分泌IL－8等趨化因子從而募集嗜中性白細(xì)胞，進(jìn)而上調(diào)蛋白酶活性，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等［3］。CXCL5屬于（ELR＋）CXC趨化因子，推斷其通過促進(jìn)血管形成和募集炎癥細(xì)胞進(jìn)而在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CXCL5在非小細(xì)胞肺癌［12］、胰腺惡性腫瘤［6］、腎癌［13］、大腸癌［14］、膽管上皮癌［15］和前列腺癌［5］中表達(dá)明顯增高，表達(dá)水平與疾病的晚期狀態(tài)、局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。近來，有學(xué)者用PCR和Western blot檢測(cè)CXCL5 在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并用shRNA 下調(diào)膀胱癌細(xì)胞T24中CXCL5的水平，可降低T24 細(xì)胞增殖、遷移能力，并通過PI3K－AKT 和ERK1／2信號(hào)途徑在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。

本研究中，免疫組化結(jié)果提示膀胱癌組織中的CXCL5 陽性率明顯高于正常膀胱組織的陽性率。CXCL5的表達(dá)水平與膀胱癌病理分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。而且CXCL5 的表達(dá)水平與膀胱癌的預(yù)后有關(guān)，CXCL5表達(dá)越高，預(yù)后也越差。我們推斷CXCL5在膀胱癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中可能扮演了較為重要角色，參與的機(jī)制可能有：①CXCL5 激活癌細(xì)胞的PI3K－AKT 和ERK1／2 信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲。此外，在體外研究中，CXCL5對(duì)中性粒細(xì)胞有直接趨化作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，癌細(xì)胞中CXCL5的上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及肺轉(zhuǎn)移，瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目也增加［17］。②CXCL5 與CXCR2受體結(jié)合使腫瘤細(xì)胞易于移動(dòng)，腫瘤細(xì)胞骨架重建；CXCL5促進(jìn)腫瘤形成的新生血管或作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要通道；CXCL5與受體結(jié)合釋放MMP－9，使基質(zhì)屏障破壞，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［18］。③CXCL5與受體結(jié)合后通過PI3K－AKT 和MAPK 信號(hào)通路，激活轉(zhuǎn)錄因子ELKl，從而激活下游一些與腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移［19］。CXCL5與受體結(jié)合后，可作用于酪氨酸激酶受體（RPTKs），從而引起趨化運(yùn)動(dòng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)［20－21］。本研究結(jié)果與前人研究類似，據(jù)此推測(cè)CXCL5可能通過促進(jìn)膀胱癌血管形成、降解癌細(xì)胞外基質(zhì)、抑制癌細(xì)胞凋亡來影響膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等。

綜上，CXCL5可能通過PI3K－AKT 和ERK1／2信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響膀胱癌的進(jìn)展和預(yù)后。趨化因子基因治療和基因疫苗有望成為膀胱癌治療的新方法。

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