產(chǎn)D—乳酸菊糖芽孢乳桿菌的誘變及發(fā)酵條件研究

劉聯(lián)杰，周安盛，方聰明，王常高+林建國+杜馨+蔡俊

摘要：以菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、硫酸二乙酯的誘變處理，采用碳酸鈣平板初篩及搖瓶復(fù)篩得到1株高產(chǎn)D-乳酸的正向突變株D11。通過單因素試驗(yàn)研究D11菌株發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸的條件。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度37 ℃，初始pH 6.5，轉(zhuǎn)速160 r/min，接種量5%，裝液量50 mL/250 mL，發(fā)酵68 h，該菌株D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高49.53%。

關(guān)鍵詞： 菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）;D-乳酸;誘變育種;正向突變

中圖分類號(hào)：Q935 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4936-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.043

Mutation Breeding and Optimization of Fermentation for Producing D-lactic Acid

with Sporolactobacillus inulinus

LIU Lian-jie， ZHOU An-sheng， FANG Cong-ming， WANG Chang-gao， LIN Jian-guo， DU Xin， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： After the original strain Sporolactiobacillus inulinus was mutated by UV and DES and selected by CaCO3 plates， a D-lactic acid yield positive mutant D11 by fermenting in shake flask was obtained. Through the single factor experiment， the fermentation conditions of producing D-lactic acid was studied. The results showed that the D-lactic acid production reached 56.18g/L when the fermentation temperature was 37 ℃，initial pH was 6.5， the rotation speed was 160 rpm/min， inoculums was 5%（V/V）， liquid volume was 50 mL/250 mL， fermentation time 68 h. The D-lactic acid production reached 56.18 g/L and was enhanced by 49.53% compared with original strain.

Key words： Sporolactobacillus inulinus; D-lactic acid; mutation breeding; forward mutation

乳酸是自然界最小的手性分子，具有L（+）和D（-）兩種光學(xué)構(gòu)型。D-乳酸作為一個(gè)手性中心，是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面的應(yīng)用十分廣泛。與L-乳酸繁榮的研究景象相比，D-乳酸的開發(fā)略顯單薄[1]。異構(gòu)體之一的D-乳酸是一種重要的手性中間體和生物可降解聚乳酸材料合成的原料。近年來石油資源的日益減少以及人們環(huán)保意識(shí)的提高，極大地促進(jìn)了通過發(fā)酵法合成D-乳酸的需求量，同時(shí)要求對(duì)其生產(chǎn)菌種的發(fā)酵性能進(jìn)行改造。研究者們利用誘變育種策略顯著提高了乳酸菌的D-乳酸產(chǎn)量[2]。

微生物誘變育種技術(shù)可選育出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變株。通過發(fā)酵條件優(yōu)化可確定微生物高效合成產(chǎn)物的最適環(huán)境[3]。目前，通過誘變選育獲得高產(chǎn)D-乳酸的工作已有一些報(bào)道，如：用甲基磺酸乙酯（EMS）對(duì)野生型Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 菌株進(jìn)行誘變，突變菌株DP3利用復(fù)雜培養(yǎng)基乳酸產(chǎn)量可達(dá)117 g/L，比出發(fā)菌種提高了75%，且具有更高的乳酸耐受能力、生長速率和轉(zhuǎn)化率[4，5]。用氮離子束對(duì)芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus）進(jìn)行誘變，突變菌株Y2-8的D-乳酸產(chǎn)量達(dá)122 g/L，比出發(fā)菌株提高了2倍。于培星[6]以凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）JD-063D為出發(fā)菌株，采用紫外線、硫酸二乙酯、鈷60γ-射線輻照、微波進(jìn)行復(fù)合誘變，得到正突變菌株，進(jìn)行發(fā)酵檢測(cè)和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終篩選出一株JD-76D，該菌株產(chǎn)酸由出發(fā)茵株的61 g/L提高到145 g/L，D-乳酸純度由原菌株的97.5%增加到98.7%以上。

本試驗(yàn)以紫外線和硫酸二乙酯誘變處理的方法，對(duì)菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus）的選育及誘變后的最適發(fā)酵條件（發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量等）進(jìn)行了研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌種

菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus），本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 ?培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖2%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%， 瓊脂2%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.2～6.5。

種子培養(yǎng)基（液體MRS）：蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖 2%，檸檬酸銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，吐溫80 0.1%，硫酸鎂0.02%，硫酸錳0.005%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.2～6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，酵母抽提物0.5%，葡萄糖10%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.3%，硫酸鎂0.01%，發(fā)酵前一次性添加碳酸鈣5%，115 ℃滅菌30 min，pH 6.5。

碳酸鈣初篩平板培養(yǎng)基：在上述斜面培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入碳酸鈣5%。

1.3 ?誘變方法

1.3.1 ?細(xì)胞懸浮液的制備 ?取活化后的斜面菌種一環(huán)，接入50 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，取10 mL轉(zhuǎn)入100 mL種子培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取10 mL該培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，菌體用10 mL生理鹽水離心洗滌2次，用玻璃珠振蕩分散，然后將菌體充分懸浮于10 mL生理鹽水中。使細(xì)胞濃度為l08 個(gè)/mL，細(xì)胞懸浮液的濃度采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.3.2 ?紫外線處理 ?紫外致死率曲線的制作：分別取1 mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈下30 cm處，開啟15 W紫外燈，預(yù)熱20 min，在磁力攪拌下，打開皿蓋，分別照射0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 s，然后取不同時(shí)間誘變處理的0.5 mL菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養(yǎng)48 h，計(jì)算每皿菌落數(shù)。計(jì)算致死率并繪制曲線。

致死率=（A-B）/A×100%（A為對(duì)照組平皿上的菌落數(shù)，B為不同時(shí)間誘變處理后平皿上的菌落數(shù)）

選擇致死率為70%～80%的處理時(shí)間作為最佳誘變時(shí)間[7]，并在此時(shí)間下進(jìn)行紫外線誘變處理。

1.3.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變 ?取硫酸二乙酯原液5 mL，加入到5 mL無水乙醇搖勻溶解，將經(jīng)紫外誘變得到的誘變菌株制備菌懸液與硫酸二乙酯溶液混勻，自加入硫酸二乙酯溶液后開始計(jì)時(shí)，在37 ℃、160 r/min的搖床內(nèi)振蕩反應(yīng)，處理一定時(shí)間后加入硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，并涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養(yǎng)48 h，計(jì)算每皿的菌落數(shù)。計(jì)算致死率（計(jì)算方法同紫外誘變）并繪制曲線。

1.4 ?誘變菌株的篩選

1.4.1 ?初篩 ?將經(jīng)過誘變處理的菌液涂布于碳酸鈣初篩平板上，37 ℃避光培養(yǎng)48 h后，觀察變色圈的大小，測(cè)定變色圈直徑和菌落直徑之比（即HC值），挑選HC值大的菌株保藏。

1.4.2 復(fù)篩

1）種子液制備。取初篩獲得的菌株一環(huán)接入50 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，取10 mL轉(zhuǎn)入100 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h即得。

2）發(fā)酵復(fù)篩。將上述種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37 ℃搖床發(fā)酵培養(yǎng)72 h，測(cè)定其D-乳酸含量，選取產(chǎn)量高的菌株保存。

3）遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。選取誘變后得到D-乳酸含量較高的變異菌株連續(xù)傳代7次，測(cè)定D-乳酸含量。

1.5 ?分析方法

1.5.1 ?D-乳酸含量的測(cè)定 ?采用高效液相色譜法，色譜分離柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）; 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器;波長：210 nm;流速：0.5 mL/min;柱溫：35 ℃;流動(dòng)相：0.2 mmol的硫酸銅。

1.5.2 ?總酸含量的測(cè)定 ?采用EDTA定鈣滴定法[8]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?出發(fā)菌株生長曲線

出發(fā)菌株菊糖芽孢乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)的生長曲線見圖1。從圖1可看出，該菌株的對(duì)數(shù)生長期為16～28 h，根據(jù)此對(duì)數(shù)生長期，選取培養(yǎng)時(shí)間為24 h的細(xì)胞作為誘變用細(xì)胞。

2.2 ?菊糖芽孢乳桿菌的誘變

2.2.1 ?紫外線處理對(duì)出發(fā)菌株存活的影響 ?紫外線對(duì)出發(fā)菌株的誘變致死曲線見圖2。從圖2可知，隨著紫外線照射時(shí)間延長，菊糖芽孢乳桿菌的致死率逐漸升高，有研究表明，較低劑量容易出現(xiàn)正突變，一般選擇致死率為70%～80%的劑量。從紫外線致死曲線可看出，當(dāng)照射時(shí)間為20 s時(shí)致死率達(dá)到80.7%。因此選擇20 s作為紫外誘變的最佳誘變時(shí)間。

2.2.2 ?紫外線誘變突變株的篩選

1）紫外誘變突變株的平板初篩。對(duì)L0紫外線誘變后，挑取單菌落，測(cè)定HC值，并進(jìn)行編號(hào)，結(jié)果見表1。由表1可看出，在挑選的16株單菌落中有8株的HC值比出發(fā)菌株L0大。選擇這8株突變株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。

2）紫外誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對(duì)HC值比出發(fā)菌株L0大的8株突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，由表2可以看出，U6、U8、U9的D-乳酸產(chǎn)量高于L0，而其他菌種的D-乳酸產(chǎn)量低于L0，說明僅有U6、U8、U9菌株發(fā)生了正向突變，其他菌種則發(fā)生了負(fù)向突變，所以對(duì)U6、U8、U9菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。

3）紫外誘變突變株的穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別對(duì)這3株菌進(jìn)行發(fā)酵傳代試驗(yàn)，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是U6的乳酸產(chǎn)量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結(jié)果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對(duì)紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時(shí)間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當(dāng)處理時(shí)間為25 min時(shí)致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時(shí)間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對(duì)U6菌株進(jìn)行DES誘變后，挑取單菌落，測(cè)定HC值，并進(jìn)行編號(hào)，結(jié)果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發(fā)菌株U6大，所以選擇這7株突變株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對(duì)HC值比出發(fā)菌株U6大的7株突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表5。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產(chǎn)量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進(jìn)行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)。

4）DES誘變突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別將這4株菌連續(xù)傳代7次，每代分別進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定D-乳酸產(chǎn)量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產(chǎn)量最高，而且每一代的乳酸產(chǎn)量變化不大，故選擇突變株D11為目標(biāo)菌株。

2.3 ?對(duì)誘變菌株發(fā)酵條件的研究

在得到一株遺傳穩(wěn)定性好的菌株后，需要對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究。試驗(yàn)就其發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量進(jìn)行了單因素試驗(yàn)驗(yàn)（圖4）。從圖4中可以得出，在發(fā)酵時(shí)間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發(fā)酵條件下，對(duì)該菌株進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)酵試驗(yàn)，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)到56.18 g/L，表明此發(fā)酵條件的可行。

3 ?小結(jié)與討論

通過對(duì)L0進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產(chǎn)量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續(xù)傳代7次，D-乳酸產(chǎn)量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，之后又通過對(duì)發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明在發(fā)酵時(shí)間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，該誘變菌株的D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到了56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高了49.53%。與付衛(wèi)明[9]、李小平等[10]的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間明顯縮短，紫外照射時(shí)間明顯減少，但是D-乳酸產(chǎn)量仍然較高，且與出發(fā)菌株相比，D-乳酸的產(chǎn)量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達(dá)到，成本節(jié)約，也為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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3）紫外誘變突變株的穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別對(duì)這3株菌進(jìn)行發(fā)酵傳代試驗(yàn)，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是U6的乳酸產(chǎn)量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結(jié)果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對(duì)紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時(shí)間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當(dāng)處理時(shí)間為25 min時(shí)致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時(shí)間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對(duì)U6菌株進(jìn)行DES誘變后，挑取單菌落，測(cè)定HC值，并進(jìn)行編號(hào)，結(jié)果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發(fā)菌株U6大，所以選擇這7株突變株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對(duì)HC值比出發(fā)菌株U6大的7株突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表5。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產(chǎn)量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進(jìn)行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)。

4）DES誘變突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別將這4株菌連續(xù)傳代7次，每代分別進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定D-乳酸產(chǎn)量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產(chǎn)量最高，而且每一代的乳酸產(chǎn)量變化不大，故選擇突變株D11為目標(biāo)菌株。

2.3 ?對(duì)誘變菌株發(fā)酵條件的研究

在得到一株遺傳穩(wěn)定性好的菌株后，需要對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究。試驗(yàn)就其發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量進(jìn)行了單因素試驗(yàn)驗(yàn)（圖4）。從圖4中可以得出，在發(fā)酵時(shí)間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發(fā)酵條件下，對(duì)該菌株進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)酵試驗(yàn)，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)到56.18 g/L，表明此發(fā)酵條件的可行。

3 ?小結(jié)與討論

通過對(duì)L0進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產(chǎn)量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續(xù)傳代7次，D-乳酸產(chǎn)量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，之后又通過對(duì)發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明在發(fā)酵時(shí)間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，該誘變菌株的D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到了56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高了49.53%。與付衛(wèi)明[9]、李小平等[10]的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間明顯縮短，紫外照射時(shí)間明顯減少，但是D-乳酸產(chǎn)量仍然較高，且與出發(fā)菌株相比，D-乳酸的產(chǎn)量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達(dá)到，成本節(jié)約，也為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸奠定了一定的基礎(chǔ)。

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3）紫外誘變突變株的穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別對(duì)這3株菌進(jìn)行發(fā)酵傳代試驗(yàn)，每株菌傳代7次，從表3中可以看出，3株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是U6的乳酸產(chǎn)量最高，所以選擇U6紫外誘變菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.3 ?硫酸二乙酯（DES）誘變突變株的選育結(jié)果

1）硫酸二乙酯誘變致死曲線的繪制。DES對(duì)紫外誘變菌株U6的誘變致死曲線見圖3。從圖3可知，隨著DES作用時(shí)間的延長，U6菌株的致死率逐漸升高。從DES致死曲線可看出，當(dāng)處理時(shí)間為25 min時(shí)致死率大約為80%。因此選擇25 min作為硫酸二乙酯誘變的最佳誘變時(shí)間。

2）DES誘變突變株的平板初篩。對(duì)U6菌株進(jìn)行DES誘變后，挑取單菌落，測(cè)定HC值，并進(jìn)行編號(hào)，結(jié)果見表4。由表4可看出，在挑選的13株單菌落中有7株的HC值比出發(fā)菌株U6大，所以選擇這7株突變株進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩。

3）硫酸二乙酯誘變突變株的發(fā)酵復(fù)篩。對(duì)HC值比出發(fā)菌株U6大的7株突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果見表5。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，D1、D5、D10和D11的D-乳酸產(chǎn)量均高于U6。所以選用這4株誘變菌株進(jìn)行第二輪搖瓶發(fā)酵復(fù)篩試驗(yàn)。

4）DES誘變突變株的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別將這4株菌連續(xù)傳代7次，每代分別進(jìn)行發(fā)酵測(cè)定D-乳酸產(chǎn)量，結(jié)果見表6。從表6中可以看出，4株菌的遺傳穩(wěn)定性均較好，但是D11誘變菌株的乳酸產(chǎn)量最高，而且每一代的乳酸產(chǎn)量變化不大，故選擇突變株D11為目標(biāo)菌株。

2.3 ?對(duì)誘變菌株發(fā)酵條件的研究

在得到一株遺傳穩(wěn)定性好的菌株后，需要對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行研究。試驗(yàn)就其發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量進(jìn)行了單因素試驗(yàn)驗(yàn)（圖4）。從圖4中可以得出，在發(fā)酵時(shí)間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL是該紫外、硫酸二乙酯誘變菌株的最佳誘變條件。

在最佳發(fā)酵條件下，對(duì)該菌株進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)酵試驗(yàn)，D-乳酸的產(chǎn)量達(dá)到56.18 g/L，表明此發(fā)酵條件的可行。

3 ?小結(jié)與討論

通過對(duì)L0進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯的誘變，碳酸鈣平板初篩及搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，從大量突變株中篩選得到一株D-乳酸變異菌株D11，其D-乳酸的產(chǎn)量從最初的37.57 g/L提高到50.84 g/L，提高了35.32%。連續(xù)傳代7次，D-乳酸產(chǎn)量變化不大，說明該突變菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，之后又通過對(duì)發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)，結(jié)果表明在發(fā)酵時(shí)間為68 h，發(fā)酵溫度為37 ℃，初始pH為6.5，轉(zhuǎn)速為160 r/min，接種量為5%，裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，該誘變菌株的D-乳酸產(chǎn)量達(dá)到了56.18 g/L，比出發(fā)菌種提高了49.53%。與付衛(wèi)明[9]、李小平等[10]的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)的發(fā)酵時(shí)間明顯縮短，紫外照射時(shí)間明顯減少，但是D-乳酸產(chǎn)量仍然較高，且與出發(fā)菌株相比，D-乳酸的產(chǎn)量增高明顯。而且此誘變條件操作簡單，容易達(dá)到，成本節(jié)約，也為該菌的工業(yè)化生產(chǎn)D-乳酸奠定了一定的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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