HMGB1和血管內(nèi)皮生長因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的作用

張國鋒等

【摘要】 目的 探討高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)及其在腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤中的意義。方法 收集經(jīng)病理證實為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的石蠟標(biāo)本50例、同期相應(yīng)瘤旁組織15例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)S-P染色輔以計算機圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果的方法， 研究HMGB1、VEGF在各組標(biāo)本中的表達(dá)及意義。結(jié)果 HMGB1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)（145.16±10.55）與其在瘤旁組織中表達(dá)（103.47±6.07）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)（148.57±9.77）與其在瘤旁組織中的表達(dá)（105.28±1.62）相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。相關(guān)分析顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1與VEGF的表達(dá)成正相關(guān)（r=0.422， P=0.001）。結(jié)論 HMGB1和VEGF的高表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)， 參與了腫瘤血管浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，給臨床靶向治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供了新的思路。

【關(guān)鍵詞】 兒童；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；高遷移率族蛋白B1；血管內(nèi)皮生長因子；免疫組織化學(xué)

【Abstract】 Objective To explore the expressions of high mobility group box protein 1 （HMGB1） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in pediatric neuroblastoma tissue and their significance in tumor node metastasis and blood vessel invasion. Methods A total of 50 paraffin samples of diagnosed neuroblastoma and 15 adjacent tissues in the same period were selected. The expressions and significance of HMGB1 and VEGF in the groups were analyzed by immunohistochemical S-P dyeing method and computer image analysis system. Results The expression of HMGB1 in the neuroblastoma tissue was （145.16±10.55）， and that in adjacent tissue was （103.47±6.07）. The difference had statistical significance （P<0.05）. There were statistically significant difference of expressions of VEGF in neuroblastoma tumor tissue （148.57±9.77） and in adjacent tissue （105.28±1.62） （P<0.05）. The related analysis showed that there was positive correlation between the expressions of HMGB1 with VEGF in neuroblastoma tissue （r=0.422， P=0.001）. Conclusion The high level expressions of HMGB1 and VEGF are correlated with infiltration and metastasis of neuroblastoma， tumor node metastasis and blood vessel invasion. They can provide new idea in the targeted therapy of neuroblastoma.

【Key words】 Children； Neuroblastoma； High mobility group box protein 1； Vascular endothelial growth factor； Immunohistochemistry

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma， NB）是兒童最常見的惡性實體腫瘤， 該腫瘤發(fā)病部位隱匿， 惡性程度高， 早期診斷困難， 易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移。臨床中許多神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移， HMGB1（high mobility group box protein 1）是近年來發(fā)現(xiàn)在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中起著主要作用的炎癥介質(zhì)， 有文獻(xiàn)報道HMGB1與乳腺癌、胃癌等多種腫瘤的浸潤、生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。作者研究了50例神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織、15例瘤旁組織中的HMGB1和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor ， VEGF）的表達(dá)情況， 評價HMGB1、VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤血管浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及意義。報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 取鄭州市兒童醫(yī)院2005年1月～2012年1月小兒外科手術(shù)存檔神經(jīng)母細(xì)胞瘤標(biāo)本蠟塊50例， 男30例， 女20例， 平均年齡3.0歲， 所有患兒均經(jīng)病理證實；同期患兒15例相應(yīng)瘤旁組織。

1. 2 試劑 免疫組化試劑：抗HMGB1為兔抗人多克隆抗體濃縮型（北京博奧森生物技術(shù)公司）， VEGF抗體為兔抗人多克隆抗體即用型（購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1. 3 免疫組織化學(xué)染色 采用S-P染色法， 二抗采用通用型PV-9000。石蠟切片厚約4 μm， 操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行， HMGB1抗體的稀釋濃度1∶200， VEGF抗體稀釋濃度為1∶100。endprint

1. 4 結(jié)果判斷并計算機輔助圖像分析 選用OlympusBh2研究顯微鏡， 在鏡下觀察HMGB1和VEGF的表達(dá)， 指標(biāo)如下：陽性區(qū)域累積光密度值（IOD）， 陽性區(qū)域面積（area）， 陽性區(qū)域平均積分光密度值（AIOD）， 公式為：AIOD=IOD/area， AIOD代表目的蛋白表達(dá)水平。

3 討論

腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、生長是一個復(fù)雜過程， 也是腫瘤復(fù)發(fā)的一個重要因素。腫瘤能否在轉(zhuǎn)移部位生存， 以及腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處播散， 這個過程中腫瘤內(nèi)血管生成是必備條件之一， 更是腫瘤復(fù)發(fā)的重要前提。目前許多腫瘤專家提出抑制腫瘤內(nèi)部血管生成可以阻斷腫瘤的生長、侵襲， 進(jìn)而可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移， 減少腫瘤復(fù)發(fā)， 這一點已經(jīng)得到大家公認(rèn)。許多研究表明腫瘤血管生成受到來自腫瘤細(xì)胞自身及其宿主細(xì)胞分泌的血管生成抑制因子和刺激因子的調(diào)節(jié)。VEGF是目前被認(rèn)為是腫瘤組織中促血管生成的最主要的血管生長因子[2] ， VEGF在血管形成和浸潤過程中起重要的調(diào)控作用。文獻(xiàn)報道VEGF 在許多腫瘤中高表達(dá)， 腫瘤組織中高表達(dá)的VEGF與腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)， 其在腫瘤組織中誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞成熟， 這些成熟活化的內(nèi)皮細(xì)胞可以形成新的血管， 為腫瘤組織輸送營養(yǎng)物質(zhì)[3]。本組試驗資料結(jié)果顯示， 血管內(nèi)皮生長因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 表明了VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管形成及發(fā)展中起到了重要的作用。

HMGB1 是一種核內(nèi)蛋白， 其參與細(xì)胞核內(nèi)多種生物學(xué)功能， 不但在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)過程中起著重要的作用， 同時HMGB1又作為一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白， 在協(xié)助基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定細(xì)胞核、調(diào)節(jié)甾體受體活性方面起著決定性作用。細(xì)胞主要通過兩種不同的途徑釋放HMGB1：一是HMGB1由活化的免疫細(xì)胞主動分泌到細(xì)胞外[4]；另一條途徑是HMGB1由壞死的細(xì)胞被動釋放到細(xì)胞外[5]。目前的研究表明分泌到細(xì)胞外的HMGB1，可能與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增生分化、神經(jīng)軸突生長密切相關(guān)[6]。本組資料神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1蛋白的表達(dá)明顯高于瘤旁組織， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 與其在多種腫瘤， 如胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等具有高表達(dá)結(jié)果一致[7]。說明HMGB1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、細(xì)胞增生分化過程中同樣有著重要的意義。在本組試驗中在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.422， P=0.001）， 提示可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移過程中， HMGB1起到了促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。表明HMGB1、VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起著重要的作用。

通過本實驗研究， 作者認(rèn)為在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中HMGB1和VEGF起著重要的作用， 為臨床下一步基因治療提供了新的思路和方向。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃俊輝， 李洋， 劉亮，等. VEGF-C介導(dǎo)的乳腺癌腫瘤淋巴管生成及定位. 中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版， 2006，31（1）：36-39，51.

[2] Qing Y， Shuo W， Zhi HW， et al. The in vitro antitumor effect and in vivo tumor-specificity distribution of human mouse chimeric antibody against transferrin receptor. Cancer Immunol Immunother， 2006， 55（9）：1111-1121.

[3] Chen A， Cuevas I， Kenny PA， et al. Endothelial cell migration and vascular endothelial growth factor expression are the result of loss of breast tissue polarity. Cancer Res， 2009， 69（16）：6721-6729.

[4] Wang H， Bloom O， Zhang M， et al. HMGB1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science， 1999， 285（5425）：248-251.

[5] Scaffidi P， Misteli T， Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature， 2002， 418 （6894）：191-195.

[6] Thorburn J， Frankel AE， ThorburnA. Regulation of HMGB1 release by autophagy. Autophagy， 2009， 5（2）：247-249.

[7] Chung HW， Lee SG， Kim H ， et al. Serum high mobility group box-1 （HMGB1） is closely associated with the clinical and pathologic features of gastric cancer. J Transl Med， 2009（7）：38.

[收稿日期：2014-08-22]endprint

1. 4 結(jié)果判斷并計算機輔助圖像分析 選用OlympusBh2研究顯微鏡， 在鏡下觀察HMGB1和VEGF的表達(dá)， 指標(biāo)如下：陽性區(qū)域累積光密度值（IOD）， 陽性區(qū)域面積（area）， 陽性區(qū)域平均積分光密度值（AIOD）， 公式為：AIOD=IOD/area， AIOD代表目的蛋白表達(dá)水平。

3 討論

腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、生長是一個復(fù)雜過程， 也是腫瘤復(fù)發(fā)的一個重要因素。腫瘤能否在轉(zhuǎn)移部位生存， 以及腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處播散， 這個過程中腫瘤內(nèi)血管生成是必備條件之一， 更是腫瘤復(fù)發(fā)的重要前提。目前許多腫瘤專家提出抑制腫瘤內(nèi)部血管生成可以阻斷腫瘤的生長、侵襲， 進(jìn)而可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移， 減少腫瘤復(fù)發(fā)， 這一點已經(jīng)得到大家公認(rèn)。許多研究表明腫瘤血管生成受到來自腫瘤細(xì)胞自身及其宿主細(xì)胞分泌的血管生成抑制因子和刺激因子的調(diào)節(jié)。VEGF是目前被認(rèn)為是腫瘤組織中促血管生成的最主要的血管生長因子[2] ， VEGF在血管形成和浸潤過程中起重要的調(diào)控作用。文獻(xiàn)報道VEGF 在許多腫瘤中高表達(dá)， 腫瘤組織中高表達(dá)的VEGF與腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)， 其在腫瘤組織中誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞成熟， 這些成熟活化的內(nèi)皮細(xì)胞可以形成新的血管， 為腫瘤組織輸送營養(yǎng)物質(zhì)[3]。本組試驗資料結(jié)果顯示， 血管內(nèi)皮生長因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 表明了VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管形成及發(fā)展中起到了重要的作用。

HMGB1 是一種核內(nèi)蛋白， 其參與細(xì)胞核內(nèi)多種生物學(xué)功能， 不但在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)過程中起著重要的作用， 同時HMGB1又作為一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白， 在協(xié)助基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定細(xì)胞核、調(diào)節(jié)甾體受體活性方面起著決定性作用。細(xì)胞主要通過兩種不同的途徑釋放HMGB1：一是HMGB1由活化的免疫細(xì)胞主動分泌到細(xì)胞外[4]；另一條途徑是HMGB1由壞死的細(xì)胞被動釋放到細(xì)胞外[5]。目前的研究表明分泌到細(xì)胞外的HMGB1，可能與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增生分化、神經(jīng)軸突生長密切相關(guān)[6]。本組資料神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1蛋白的表達(dá)明顯高于瘤旁組織， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 與其在多種腫瘤， 如胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等具有高表達(dá)結(jié)果一致[7]。說明HMGB1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、細(xì)胞增生分化過程中同樣有著重要的意義。在本組試驗中在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.422， P=0.001）， 提示可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移過程中， HMGB1起到了促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。表明HMGB1、VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起著重要的作用。

通過本實驗研究， 作者認(rèn)為在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中HMGB1和VEGF起著重要的作用， 為臨床下一步基因治療提供了新的思路和方向。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃俊輝， 李洋， 劉亮，等. VEGF-C介導(dǎo)的乳腺癌腫瘤淋巴管生成及定位. 中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版， 2006，31（1）：36-39，51.

[2] Qing Y， Shuo W， Zhi HW， et al. The in vitro antitumor effect and in vivo tumor-specificity distribution of human mouse chimeric antibody against transferrin receptor. Cancer Immunol Immunother， 2006， 55（9）：1111-1121.

[3] Chen A， Cuevas I， Kenny PA， et al. Endothelial cell migration and vascular endothelial growth factor expression are the result of loss of breast tissue polarity. Cancer Res， 2009， 69（16）：6721-6729.

[4] Wang H， Bloom O， Zhang M， et al. HMGB1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science， 1999， 285（5425）：248-251.

[5] Scaffidi P， Misteli T， Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature， 2002， 418 （6894）：191-195.

[6] Thorburn J， Frankel AE， ThorburnA. Regulation of HMGB1 release by autophagy. Autophagy， 2009， 5（2）：247-249.

[7] Chung HW， Lee SG， Kim H ， et al. Serum high mobility group box-1 （HMGB1） is closely associated with the clinical and pathologic features of gastric cancer. J Transl Med， 2009（7）：38.

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1. 4 結(jié)果判斷并計算機輔助圖像分析 選用OlympusBh2研究顯微鏡， 在鏡下觀察HMGB1和VEGF的表達(dá)， 指標(biāo)如下：陽性區(qū)域累積光密度值（IOD）， 陽性區(qū)域面積（area）， 陽性區(qū)域平均積分光密度值（AIOD）， 公式為：AIOD=IOD/area， AIOD代表目的蛋白表達(dá)水平。

3 討論

腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、生長是一個復(fù)雜過程， 也是腫瘤復(fù)發(fā)的一個重要因素。腫瘤能否在轉(zhuǎn)移部位生存， 以及腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處播散， 這個過程中腫瘤內(nèi)血管生成是必備條件之一， 更是腫瘤復(fù)發(fā)的重要前提。目前許多腫瘤專家提出抑制腫瘤內(nèi)部血管生成可以阻斷腫瘤的生長、侵襲， 進(jìn)而可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移， 減少腫瘤復(fù)發(fā)， 這一點已經(jīng)得到大家公認(rèn)。許多研究表明腫瘤血管生成受到來自腫瘤細(xì)胞自身及其宿主細(xì)胞分泌的血管生成抑制因子和刺激因子的調(diào)節(jié)。VEGF是目前被認(rèn)為是腫瘤組織中促血管生成的最主要的血管生長因子[2] ， VEGF在血管形成和浸潤過程中起重要的調(diào)控作用。文獻(xiàn)報道VEGF 在許多腫瘤中高表達(dá)， 腫瘤組織中高表達(dá)的VEGF與腫瘤的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)， 其在腫瘤組織中誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞成熟， 這些成熟活化的內(nèi)皮細(xì)胞可以形成新的血管， 為腫瘤組織輸送營養(yǎng)物質(zhì)[3]。本組試驗資料結(jié)果顯示， 血管內(nèi)皮生長因子在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 表明了VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管形成及發(fā)展中起到了重要的作用。

HMGB1 是一種核內(nèi)蛋白， 其參與細(xì)胞核內(nèi)多種生物學(xué)功能， 不但在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)過程中起著重要的作用， 同時HMGB1又作為一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白， 在協(xié)助基因轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定細(xì)胞核、調(diào)節(jié)甾體受體活性方面起著決定性作用。細(xì)胞主要通過兩種不同的途徑釋放HMGB1：一是HMGB1由活化的免疫細(xì)胞主動分泌到細(xì)胞外[4]；另一條途徑是HMGB1由壞死的細(xì)胞被動釋放到細(xì)胞外[5]。目前的研究表明分泌到細(xì)胞外的HMGB1，可能與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞增生分化、神經(jīng)軸突生長密切相關(guān)[6]。本組資料神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1蛋白的表達(dá)明顯高于瘤旁組織， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）， 與其在多種腫瘤， 如胃癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等具有高表達(dá)結(jié)果一致[7]。說明HMGB1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、細(xì)胞增生分化過程中同樣有著重要的意義。在本組試驗中在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中HMGB1和VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.422， P=0.001）， 提示可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移過程中， HMGB1起到了促進(jìn)轉(zhuǎn)移的作用。表明HMGB1、VEGF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中可能起著重要的作用。

通過本實驗研究， 作者認(rèn)為在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中HMGB1和VEGF起著重要的作用， 為臨床下一步基因治療提供了新的思路和方向。

參考文獻(xiàn)

[1] 黃俊輝， 李洋， 劉亮，等. VEGF-C介導(dǎo)的乳腺癌腫瘤淋巴管生成及定位. 中南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版， 2006，31（1）：36-39，51.

[2] Qing Y， Shuo W， Zhi HW， et al. The in vitro antitumor effect and in vivo tumor-specificity distribution of human mouse chimeric antibody against transferrin receptor. Cancer Immunol Immunother， 2006， 55（9）：1111-1121.

[3] Chen A， Cuevas I， Kenny PA， et al. Endothelial cell migration and vascular endothelial growth factor expression are the result of loss of breast tissue polarity. Cancer Res， 2009， 69（16）：6721-6729.

[4] Wang H， Bloom O， Zhang M， et al. HMGB1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science， 1999， 285（5425）：248-251.

[5] Scaffidi P， Misteli T， Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature， 2002， 418 （6894）：191-195.

[6] Thorburn J， Frankel AE， ThorburnA. Regulation of HMGB1 release by autophagy. Autophagy， 2009， 5（2）：247-249.

[7] Chung HW， Lee SG， Kim H ， et al. Serum high mobility group box-1 （HMGB1） is closely associated with the clinical and pathologic features of gastric cancer. J Transl Med， 2009（7）：38.

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