紅景天苷對腹水型H22肝癌抑制作用及其機(jī)制的初步研究

何小喜，莫書榮

(廣西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

紅景天是長期生長于高寒、缺氧、干燥、強(qiáng)紫外線輻射等惡劣環(huán)境的多年生稀有藥用草本植物［1］，其主要有效成分之一是一種具有高免疫活性的化合物——紅景天苷。據(jù)文獻(xiàn)［2－4］報(bào)道，紅景天苷對腫瘤生長有積極的防治作用，體外對肝癌細(xì)胞如肝癌QGY-7703細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞和肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞等均有抑制增殖作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也證實(shí)［5］，紅景天苷能抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但紅景天苷對小鼠肝癌H22細(xì)胞的體內(nèi)外抑瘤活性尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對此進(jìn)行研究，為紅景天苷應(yīng)用于臨床腫瘤防治提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 紅景天苷購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào):12052507，規(guī)格:2 g/支，HPLC≥98%，用前以0.9%的氯化鈉注射液配為50 g·L－1的儲(chǔ)存濃度，4℃保存;苦參堿購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào):11061201，規(guī)格:1 g/支，HPLC≥98%，用前以0.9%的氯化鈉注射液配為5 g·L－1，現(xiàn)配現(xiàn)用;IL-2和IL-12 ELISA試劑盒購自美國RayBiotech公司。

1.2 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠腹水型H22肝癌細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物教研室惠贈(zèng)，在小鼠腹腔內(nèi)傳代培養(yǎng)。清潔級(jí)BALB/c小鼠(20±2)g，♀♂兼用，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK桂2003－0003。

1.3 荷瘤小鼠模型的建立、分組、給藥及測量指標(biāo)參考文獻(xiàn)［6－7］方法，無菌條件下從接種7～9 d的腹水型肝癌H22荷瘤小鼠腹腔中抽取含H22細(xì)胞的乳白色瘤液，用無菌PBS調(diào)整稀釋至1×1010·L－1。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，鏡檢腫瘤細(xì)胞存活率不低于95%。(1)腹水瘤模型:于BALB/c小鼠腹部行無菌腹腔注射腹水稀釋液，0.2 ml/只。接種后24 h，將小鼠稱重，隨機(jī)分為5組，紅景天苷低、中、高劑量組，分別給予紅景天苷20、40、80 mg·kg－1;苦參堿組及陰性對照組，分別給予苦參堿50 mg·kg－1及生理鹽水0.2 ml/只，每組20只，♀♂各半，ip給藥，每日1次，連續(xù)8 d。觀察指標(biāo):①從給藥當(dāng)日起至給藥結(jié)束，每日觀察小鼠一般情況，隔日稱重一次，記錄體重變化。②停藥后24 h，各組小鼠稱重后處死一半，抽取腹水，記錄腹水量;另一半小鼠觀察生存時(shí)間，計(jì)算平均生命延長率/%:生命延長率/%=(T/C－1)×100%，T為治療組平均生存天數(shù)，C為對照組平均生存天數(shù)。(2)實(shí)體瘤模型:于BALB/c小鼠左腋行無菌皮下注射腹水稀釋液，0.2 ml/只。接種后24 h，將小鼠稱重，隨機(jī)分組和給藥劑量同上，每組10只，♀♂各半，ip給藥，每日1次，連續(xù)8 d。觀察指標(biāo):停藥后24 h，各組小鼠稱重后摘除眼球取血，制備血清，ELISA法檢測血清中IL-2、IL-12水平;取血后頸椎脫臼處死，剝瘤、摘取脾臟并稱重，計(jì)算抑瘤率及脾臟系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 腹水瘤模型小鼠一般情況觀察結(jié)果 給藥期間，荷瘤小鼠一般情況隨紅景天苷給藥濃度增加而逐級(jí)改善。高劑量組小鼠精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)良好，糞便成形且濕潤，皮毛順滑、有光澤，腹部膨隆速度緩慢;NS組小鼠精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)均差，糞便稀爛、不成形，皮毛無光澤、甚至脫毛，腹部膨隆速度快，總體情況均差于低、中劑量組;苦參堿組小鼠一般情況最差，表現(xiàn)為精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)最差，糞便稀爛、不成形，皮毛干燥并脫毛，但腹部膨隆速度緩慢。表明紅景天苷能明顯改善荷瘤小鼠的一般情況。

2.2 紅景天苷對腹水瘤小鼠體重及腹水量的影響治療前5組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，隨治療時(shí)間延長，NS組小鼠體重增長迅速，各劑量紅景天苷組小鼠體重增長較慢。至治療結(jié)束時(shí)，中、高劑量組小鼠平均體重與NS組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，與苦參堿組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Fig 1。經(jīng)治療后，紅景天苷能有效減少小鼠腹水量，中、高劑量組小鼠腹水量與NS組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，低劑量組與高劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見Tab 1。提示紅景天苷能改善荷瘤小鼠的生活質(zhì)量，減少腹水生成量。

Fig 1 Influence of salidroside on H22mice body weight

Tab 1 Influence of salidroside on ascites vol in tumor-bearing mice(n=10)

2.3 紅景天苷對腹水瘤小鼠生存時(shí)間及生命延長率的影響 NS組小鼠從d 9開始出現(xiàn)死亡，到d 15全部死亡，而紅景天苷各劑量組小鼠到d 12才開始出現(xiàn)死亡。紅景天苷各劑量組與NS組比較生存時(shí)間延長，見Fig 2。低、中、高3個(gè)劑量組小鼠生存時(shí)間與NS組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與苦參堿組相比，則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見Tab 2。提示紅景天苷能提高荷瘤小鼠的生命延長率。

2.4 紅景天苷對實(shí)體瘤小鼠的抑瘤作用 紅景天苷對皮下移植瘤模型表現(xiàn)出明顯的抑瘤效果，各劑量組小鼠腫瘤重量與NS組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。經(jīng)治療后，小鼠體質(zhì)量得到明顯提高，尤其中、高劑量組效果明顯(P＜0.01)，苦參堿不能提高甚至降低小鼠體質(zhì)量，與NS組及紅景天苷各劑量組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見 Tab 3。

Tab 2 Survival time and life extension rate in tumor-bearing mice(n=10)

Fig 2 Comparison of the survival curve in each group

Tab 3 Inhibitory effect of salidroside on the tumor weight in tumor-bearing mice(n=10)

2.5 紅景天苷對實(shí)體瘤小鼠脾臟系數(shù)、血清IL-2、IL-12水平的影響 經(jīng)治療后，各劑量組小鼠血清IL-2水平明顯高于NS組和苦參堿組，差異均有顯著性(P＜0.05);血清IL-12水平在各劑量組中也有不同程度增高，以高劑量組效果明顯(P＜0.01)，低劑量組與NS組比較，差異無顯著性(P＞0.05);與NS組和苦參堿組相比，中、高劑量組脾臟系數(shù)明顯提高，見Tab 4。提示紅景天苷能提高荷瘤小鼠免疫功能。

3 討論

據(jù)WTO統(tǒng)計(jì)，全球50多億人口中平均每年有690萬人死于惡性腫瘤，有870萬的腫瘤新發(fā)病例，且數(shù)字呈現(xiàn)逐年增漲趨勢［8］。惡性腫瘤具有發(fā)病率高、治愈率低、致死率高等特點(diǎn)，對人類的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前各種化療藥物的臨床應(yīng)用，雖然抑瘤作用明顯，大大提高了腫瘤治愈率，但對機(jī)體正常組織產(chǎn)生很大毒副作用，而很多傳統(tǒng)中藥具有價(jià)格低廉、毒副作用小等特點(diǎn)，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)不僅提高化療藥物療效，而且提高腫瘤患者的生存質(zhì)量，在腫瘤治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

Tab 4 Comparison of the spleen index，serum IL-2 and IL-12 in each group(n=10)

紅景天苷具有抗缺氧、抗疲勞、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理功能［9］。近年研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷對多種腫瘤細(xì)胞如肺腺癌SPC-A-1、肝癌QGY-7703細(xì)胞均有明顯抑制作用，且表現(xiàn)出高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，使紅景天苷在腫瘤防治應(yīng)用上越來越受關(guān)注。

本研究通過肝癌動(dòng)物模型觀察紅景天苷對荷瘤小鼠的影響。結(jié)果顯示紅景天苷對肝癌H22的抑瘤作用隨給藥濃度增加而增強(qiáng)，呈明顯量－效關(guān)系，同時(shí)延長荷瘤小鼠生存時(shí)間，提高生命延長率，表明紅景天苷確有抗腫瘤功效。IL-2和IL-12是機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子。在抗腫瘤免疫應(yīng)答方面，IL-12不僅能激活 NK/LAK細(xì)胞、促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，并增強(qiáng)這些免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力，而且能抑制腫瘤組織生成新生血管，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。IL-2與IL-12能協(xié)同誘導(dǎo)LAK細(xì)胞的生成，此外IL-2與IFN 7還能協(xié)同增強(qiáng) T細(xì)胞、NK細(xì)胞殺傷活性，對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用?？鄥A是目前研究比較明確的抗腫瘤中藥，有研究報(bào)道［10－11］，苦參堿能夠抑制小鼠體外淋巴細(xì)胞增殖、脾細(xì)胞IL-2分泌及LAK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，具有免疫抑制作用。本研究顯示紅景天苷組抑瘤效果雖不比苦參堿組強(qiáng)，但小鼠的一般情況卻好于苦參堿組，脾臟系數(shù)及血清IL-2、IL-12水平也明顯高于苦參堿組。說明紅景天苷發(fā)揮抗腫瘤同時(shí)，提高機(jī)體免疫功能，且對機(jī)體損傷小，無明顯不良反應(yīng)。提示將紅景天苷與常用化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，可以增強(qiáng)抗腫瘤療效，降低藥物毒副作用，改善患者的生活質(zhì)量，在腫瘤治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

紅景天苷具有明確抗腫瘤作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用有關(guān)，有待于我們進(jìn)一步深入研究具體作用機(jī)制。

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