基于氨基酸代謝的抗腦缺血益氣解毒配伍中藥協(xié)同作用研究

王軍玲，楊 陽(yáng)，高 健，方清影，李德鳳，吳傳鴻，黃志英，5，楊更亮，李韶菁

（1.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北 保定 071002；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230031；5.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 211198）

缺血性腦中風(fēng)是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病。作為目前臨床的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，缺乏有效的預(yù)防和治療手段［1－3］。近年來，中藥及其有效成分在腦缺血的預(yù)防和治療方面因其獨(dú)特的效果越來越受到人們的重視。中藥主要是通過多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)來發(fā)揮作用，且毒副作用相對(duì)較小，因此，尋找有效中藥無疑是一條值得探索的路徑，但中藥整體起效、協(xié)同調(diào)節(jié)平衡的作用尚缺乏有效的研究方法和評(píng)價(jià)手段［4－5］。

中醫(yī)理論認(rèn)為腦髓失養(yǎng)、毒邪內(nèi)生和毒傷腦髓，三者因果互濟(jì)，共同構(gòu)成了缺血性中風(fēng)急性期腦髓損傷的病理基礎(chǔ)［6］，本研究所用益氣解毒方來源于益氣解毒治法的中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，由人參、黃連、梔子3味中藥組成。此3味配伍，可以在扶正的基礎(chǔ)上，有效化解毒邪，起到很好的協(xié)同治療作用。本課題組在原方基礎(chǔ)上，采用3味中藥中的主要活性組分，即人參總皂苷、鹽酸小檗堿、梔子苷，按一定比例配伍成新的益氣解毒方。經(jīng)我們前期藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，新的益氣解毒方具有較好的抗腦缺血保護(hù)作用，可明顯降低大鼠局灶性腦缺血后的腦梗死體積，改善局部腦血流量，減輕血腦屏障損傷導(dǎo)致的腦水腫，保護(hù)受損的線粒體的結(jié)構(gòu)和功能［7］。近年來研究表明，氨基酸是腦缺血病理過程的主要參與者，其中興奮性氨基酸是缺血時(shí)最早釋放的氨基酸遞質(zhì)，主要包括谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），腦缺血后血液及腦脊液中興奮性氨基酸釋放增多，易造成興奮性氨基酸毒性。γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸（Gly）為抑制性遞質(zhì)，可抑制神經(jīng)元興奮，減少由興奮性氨基酸造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷。腦缺血損傷后，GABA濃度急劇升高，可減少由于Glu大量釋放所造成的損傷［8－10］。N-乙酰天冬氨酸（NAA）被認(rèn)為是神經(jīng)元的標(biāo)志物，其代謝紊亂時(shí)會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，引起神經(jīng)退行性病變和生理畸變。腦缺血早期，NAA的下降主要反映了神經(jīng)元功能活性下降［11］。同樣，同型半胱氨酸（Hcy）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）在腦缺血疾病發(fā)生后均會(huì)發(fā)生不同程度的變化，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［12－14］。而酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）作為體內(nèi)發(fā)揮重要生理功能的氨基酸，目前在腦缺血中發(fā)揮的作用和功能尚不太清楚，仍需深入研究?？傊?，目前國(guó)內(nèi)、外腦缺血病理研究仍多集中在興奮性和抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)上，而對(duì)其他氨基酸代謝產(chǎn)物如絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等相對(duì)研究較少，因此，系統(tǒng)研究血清中的氨基酸含量整體變化可能對(duì)從生化通路的角度揭示腦缺血機(jī)制起到重要作用。

因此，本研究擬以該配伍中藥為研究對(duì)象，采用代謝組學(xué)中常用的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，采用已建立的一套與腦缺血相關(guān)的12種內(nèi)源性氨基酸代謝物同時(shí)定量的方法［15］，從整體角度分析腦中風(fēng)急性期氨基酸代謝物水平變化，比較和評(píng)價(jià)益氣解毒方中3種組分不同給藥組合方式對(duì)氨基酸水平的調(diào)控作用，從一個(gè)新的角度探討其抗腦缺血的綜合起效和協(xié)同作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，體質(zhì)量250～270 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2012－0001。置于溫度25℃±2℃飼養(yǎng)室，動(dòng)物均自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過程依照中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器 標(biāo)準(zhǔn)品：GABA、Gly、Ala、Ser、Glu、Asp、Hcy、Met、Tyr、NAA、Phe、Trp、氘代 －丙烯酰胺（D3-acrylamide，內(nèi)標(biāo)）（購(gòu)于Sigma公司）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈為Fisher色譜純，水為Milli-Q water system（Millipore，Bedford，MA，MSA）過濾后的純水。羧甲基纖維素鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；人參總皂苷（Rg1＋Re＋Rd≥40.55% ±2.10%）（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；鹽酸小檗堿（純度≥95.18%）（咸陽(yáng)航空168生物工程有限公司）；梔子苷（純度≥99.68%）（寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司）；安捷倫1200系列快速分離液相色譜（RRLC），安捷倫電噴霧三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器（ESI-QQQ／MS），臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó) Labnet公司）；十萬級(jí)天平（AUW220D，日本島津公司）；氮吹儀（Organomation N-EVAP，南京歐熙科貿(mào)有限公司）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 160只大鼠隨機(jī)分為16組，即假手術(shù)組（sham）、模型組（vehicle）、7組給藥量為25 mg·kg－1不同組合的給藥組、7組給藥量為5 mg·kg－1不同組合的給藥組。各給藥組于手術(shù)麻醉前10 min灌胃給藥，采用0.5%的羧甲基纖維素鈉使混懸均勻。同時(shí)，假手術(shù)組和模型組則分別灌胃給予相應(yīng)容積的溶劑。益氣解毒方協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)各組具體給藥方案見Tab 1。

Tab 1 Synergistic experiment design of YQJD formula

2.2 大鼠局灶性腦缺血模型的制備 實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，10%的水合氯醛溶液（3 ml·kg－1）腹腔注射麻醉動(dòng)物。參照Longa等［16］建立的大鼠中動(dòng)脈線栓改良法，通過對(duì)大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞建立大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型（MCAO）。

2.3 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 將動(dòng)物處死前進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)觀察和打分，參照Bederson評(píng)分法進(jìn)行5分制神經(jīng)功能癥狀評(píng)分（0－4分）［17］。通常分?jǐn)?shù)越高，則說明其神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。

2.4 大鼠血清標(biāo)本采集、處理及氨基酸定量檢測(cè)大鼠造模缺血12 h后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，迅速于4℃下，4 000 r·min－1離心 15 min，取離心后的上清液，于－80℃冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

取50μl血清樣品，加入10μl內(nèi)標(biāo)使用液（終濃度為 1 000μg·L－1D3-丙烯酰胺）和 200μl乙腈，渦旋混勻1 min，再加入240μl的初始流動(dòng)相，渦旋混勻1min。然后，在4℃下，10 000 r·min－1離心5 min，取350μl上清液過濾膜進(jìn)樣。

氨基酸定量檢測(cè)方法參見文獻(xiàn)［15］，在15 min內(nèi)對(duì)已處理的每個(gè)血清樣本中未衍生化的12種內(nèi)源性氨基酸的含量同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，具體條件為：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，乙腈－0.1%甲酸水梯度洗脫，流速為0.5 ml·min－1。離子源為ESI，正離子掃描模式，掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)。

2.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用 SIMCA-P（version 12.0，Umertrics，Umea，Sweden）統(tǒng)計(jì)軟件中有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，觀察正常組與模型組之間的差異，挑選出具有明顯聚類特征的氨基酸變量。對(duì)于PLS-DA模型，Q2＞0.5，被認(rèn)為是有效模型，并且通過各變量的VIP值進(jìn)一步篩選，當(dāng)變量的VIP值大于1.0時(shí)，則認(rèn)為該變量對(duì)該模型有較大影響［18］，所以，為了關(guān)注差異明顯的變量，只選擇了VIP大于1.0的氨基酸變量［19］。然后，使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)氨基酸結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和主成分分析（PCA），研究益氣解毒方不同組合的協(xié)同作用。

3 結(jié)果

3.1 益氣解毒方對(duì)神經(jīng)功能的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯升高，差異具有顯著性（P＜0.01），說明造模成功。與模型組相比，益氣解毒方各給藥組均能降低腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，其中ABC三組分給藥組（5 mg·kg－1和25 mg·kg－1）和 AC兩組分給藥組（25 mg·kg－1）的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低（P＜0.05），能明顯改善大鼠局灶性腦缺血后12 h的神經(jīng)損傷癥狀，其中三組分共同給藥改善效果最為明顯。見Fig 1。

Fig 1 Effect of YQJD on neurological deficits induced by MCAO**P＜0.01 vs sham group；＃P＜0.05 vs vehicle group

3.2 益氣解毒方不同組分對(duì)血清中氨基酸水平的調(diào)控

3.2.1 PLS-DA分析益氣解毒方各組分對(duì)氨基酸水平的影響 通過構(gòu)建PLS-DA判別模型（Q2Y＝0.727），對(duì)正常狀態(tài)和病理狀態(tài)下氨基酸水平進(jìn)行分析。PLS-DA得分圖（Fig 2）顯示，正常組和模型組兩組結(jié)果區(qū)分較好，說明在腦缺血損傷過程中12種氨基酸水平發(fā)生了明顯變化。同時(shí)，篩選出模型組與假手術(shù)組中明顯變化的5個(gè)氨基酸（VIP＞1），即 Glu、Asp、Met、Hcy和 Phe。

Fig 2 PLS-DA score p lots derived from sham and vehicle group 12 h after MCAO by SIMCA-P12．0

3.2.2 One-Way ANOVA分析益氣解毒方各組分對(duì)氨基酸水平的影響 RRLC-QQQ定量分析研究結(jié)果顯示，缺血性腦損傷后，血清中12種氨基酸水平均發(fā)生變化，對(duì)不同組間大鼠血清中12種氨基酸的濃度分別進(jìn)行單因素方差分析。首先，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的 Glu、Asp、Met、Hcy和 Phe 5種氨基酸水平都明顯升高（P＜0.01）。其次，與模型組相比，25 mg·kg－1ABC和5 mg·kg－1ABC三組分共同給藥組大鼠中 Glu、Asp、Met、Hcy和 Phe 5種氨基酸的水平均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），說明三組分共同給藥對(duì)氨基酸水平有明顯的調(diào)控作用，能明顯改善腦缺血損傷后的異常氨基酸水平變化。同時(shí)，A單組分給藥、C單組分給藥及AC兩組分共同給藥較兩個(gè)劑量下其他給藥組均有明顯變化，同時(shí)次序依次為AC兩組分共同給藥、A單組分給藥及C單組分給藥，說明A單組分給藥、C單組分給藥及AC兩組分共同給藥對(duì)氨基酸水平也有一定調(diào)控作用。見Fig 3。

3.2.3 PCA分析益氣解毒方各組分對(duì)血清中氨基酸水平的影響 對(duì)兩種不同給藥量下（25 mg·kg－1和5 mg·kg－1）各給藥組動(dòng)物血清中氨基酸的濃度值分別進(jìn)行主成分分析，結(jié)果將12種氨基酸指標(biāo)降維為7個(gè)主成分（PC1～PC7），且前7個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)度達(dá)到86%以上，滿足累積貢獻(xiàn)度大于85%的降維標(biāo)準(zhǔn)。見Fig 4。

Fig 4 Scree plots at dosage of 5 mg·kg－1（A）and 25 mg·kg－1（B）

在給藥量為25mg·kg－1各組中，PC1、PC3、PC4三個(gè)主成分中，ABC三組分協(xié)同給藥組氨基酸水平最接近假手術(shù)組水平。說明ABC三組分共同給藥在這三個(gè)主成分中貢獻(xiàn)度較大。在給藥量為5 mg·kg－1各組中，PC1～PC5及PC7六個(gè)主成分中對(duì)應(yīng)的貢獻(xiàn)度最大的給藥組也是ABC組。而在給藥量25 mg·kg－1的 PC2、PC6和給藥量 25 mg·kg－1的PC6主成分中均顯示AC兩組分協(xié)同作用貢獻(xiàn)度較大。由以上結(jié)果可見，兩個(gè)劑量下三組分共同給藥對(duì)病理狀態(tài)下氨基酸水平的調(diào)控作用明顯優(yōu)于兩組分和單組分給藥的作用。見Fig 5。

4 討論

Fig 5 Association between values of each PCswith drugs combination（PCs at the dosage of 25 mg·kg－1 and 5 mg·kg－1）

隨著系統(tǒng)生物學(xué)（system biology）、多向藥理學(xué)（polypharmacology）和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（network pharmacology）等概念的提出，藥理學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入到一個(gè)嶄新的階段。單一靶點(diǎn)的藥物治療模式已不能滿足復(fù)雜疾病的治療要求，開發(fā)多靶點(diǎn)、多途徑、整合調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)平衡的有效組合藥物正逐漸成為現(xiàn)代藥物研發(fā)的新趨勢(shì)［20］，這無疑為開發(fā)有效治療中風(fēng)的中藥提供了良好的契機(jī)。中醫(yī)藥的系統(tǒng)、整體治療理念在臨床腦缺血治療方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尤其開發(fā)針對(duì)其關(guān)鍵病機(jī)的中藥有效組分組合作為中藥配伍的新模式，很有可能成為未來新型腦中風(fēng)治療候選藥物的有效來源。本研究抽提人參、黃連、梔子的主要藥效成分人參總皂苷、黃連素、梔子苷進(jìn)行組合，經(jīng)本課題組前期研究證明其具有明顯的抗急性腦缺血保護(hù)作用，且具有多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，該組方中人參總皂苷作為補(bǔ)益類藥物人參中的主要活性組分，其作用廣泛，在中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫和心血管系統(tǒng)中均能發(fā)揮較好的藥理作用［21－23］，例如人參皂苷 Rg、Rd均能保護(hù)海馬神經(jīng)元免受腦缺血后谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性損傷［24］。鹽酸小檗堿作為中藥黃連中的主要藥效成分，最先作為抗胃腸道感染藥物用于臨床，但近年發(fā)現(xiàn)其在治療心血管疾病、中風(fēng)、糖尿病、高血脂和慢性炎癥方面也均見諸多報(bào)道［25］，具有良好的藥用前景。同時(shí)，其作為解毒良品，在缺血／再灌注損傷中能夠清除多種氧自由基，具有抗氧化的保護(hù)作用［26］。作為經(jīng)典清熱解毒中藥復(fù)方中常用中藥梔子的主要藥效成分，梔子苷能有效減少神經(jīng)元壞死，抑制炎性和興奮性毒性產(chǎn)生，通過“解毒”也可發(fā)揮良好的抗腦缺血作用，且其抗炎作用機(jī)制可能與梔子苷能減少腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，減輕白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用，從而抑制炎癥的發(fā)生與發(fā)展［27－29］。

代謝組學(xué)是一種全面、系統(tǒng)、終點(diǎn)式的研究方法，旨在通過測(cè)定機(jī)體中代謝物的變化來反映體內(nèi)代謝物在病理狀態(tài)及藥物干預(yù)下的變化規(guī)律［30］。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究手段，對(duì)腦缺血的代謝組學(xué)開展研究，有助于從新的角度對(duì)腦缺血損傷的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，同時(shí)也可為抗中風(fēng)中藥新藥研發(fā)提供新方法。本研究通過已建立的液質(zhì)聯(lián)用RRLCQQQ方法對(duì)血清樣品中12種內(nèi)源性氨基酸同時(shí)定量檢測(cè)，對(duì)益氣解毒方不同給藥組合干預(yù)腦缺血過程中氨基酸代謝水平調(diào)控作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并采用逐層遞進(jìn)的分析方法揭示了其協(xié)同作用。首先，通過 PLS-DA判別分析挑選出 Glu、Asp、Met、Hcy和Phe 5個(gè)氨基酸可作為腦缺血的關(guān)鍵內(nèi)源性標(biāo)記物。然后，通過One-Way ANOVA及PCA對(duì)血漿中氨基酸水平的比較和綜合分析，證明了三組分組合協(xié)同作用最強(qiáng)，可明顯改善腦缺血后內(nèi)源性氨基酸的代謝水平異常，其次分別是人參總皂苷和梔子苷的兩組分協(xié)同作用、人參總皂苷單組分作用、鹽酸小檗堿單組分作用，而3個(gè)組分中人參總皂苷可能較梔子苷、鹽酸小檗堿來說發(fā)揮著更重要的作用。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果與PCA結(jié)果基本一致，佐證了益氣解毒方的協(xié)同作用，證明該方中每個(gè)組分均發(fā)揮著重要作用，三組分缺一不可。

中藥研究是一項(xiàng)復(fù)雜的系統(tǒng)工程，缺乏系統(tǒng)的方法闡釋其科學(xué)內(nèi)涵是制約其發(fā)展的瓶頸問題。本文首次從氨基酸代謝的角度證明益氣解毒方治療腦缺血各組分的協(xié)同作用，是一次從整體的角度闡述中藥協(xié)同作用的有意義的嘗試。這也為治療復(fù)雜性疾病的中藥多組分協(xié)同作用和整體調(diào)節(jié)的機(jī)制研究提供了新思路。

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