大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽對(duì)血管生成的抑制作用

劉文君，徐學(xué)清

（南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東，廣州 510515）

在過去的幾十年里，蜂毒因?yàn)楹性S多藥理活性物質(zhì)而引起了人們的密切關(guān)注，這些對(duì)于大胡蜂防御天敵和捕食等生存活動(dòng)所必須的藥理活性分子包括：多肽類，如，趨化肽、肥大細(xì)胞脫粒肽［1－2］；酶類，如，磷脂酶 A2、透明質(zhì)酸酶、酸（堿）磷酸酶［3］；有機(jī)小分子，如，組胺、膽堿、甘油、氨基酸等。眾多活性分子使蜂毒具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性，在臨床上可被應(yīng)用于治療腫瘤、風(fēng)濕和肩周炎等多種疾病。

血管生長(zhǎng)與抗腫瘤有密切聯(lián)系，很多具有血管生長(zhǎng)抑制活性的物質(zhì)同時(shí)具有抗腫瘤活性。宋長(zhǎng)城等［4］報(bào)道蜂毒有抑制血管生成作用，且推斷蜂毒抑制肝癌血管生成可能是其抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。

在過去的研究中，我們從大胡蜂毒中分離純化得到一組肥大細(xì)胞脫粒肽［2］，盡管肥大細(xì)胞脫粒肽有數(shù)種生物活性，如磷脂酶A2、磷脂酶C、G蛋白和鳥苷酸環(huán)化酶活化，細(xì)胞脫顆粒和抗菌等活性［2，5－6］，但是發(fā)現(xiàn)其具有血管生長(zhǎng)抑制活性尚屬于首次，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)用受精雞胚（10 d齡）購(gòu)自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)；Wistar大鼠：南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a（INWKGIAAMAKKLL）：本實(shí)驗(yàn)室合成；扶濟(jì)復(fù)（重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，rh-bFGF），北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，批號(hào)：20041212；0.1% 新潔爾滅：上海經(jīng)緯化工有限公司；定性濾紙：英國(guó)Whatman公司產(chǎn)品，批號(hào)：002090；帶數(shù)碼相機(jī)顯微鏡：德國(guó) Leica公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、小牛血清均來自Gibco公司；BD BioCoatTM血管生長(zhǎng)板購(gòu)自 BD Biosciences；MTT檢測(cè)試劑盒來自建成生物工程研究所；其他試劑：國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 供試品載體的制備 將過濾除菌的12a和rh-bFGF溶液分別或一起均勻涂布于直徑為5 mm的無菌Whatman濾紙上，使實(shí)驗(yàn)組紙片除含有rh-bFGF 0.2μg外，還分別含有0.1或1μg的12a，陽性對(duì)照組上含有rh-bFGF 0.2μg，陰性對(duì)照含有蒸餾水，所有紙片均自然風(fēng)干。

1.2.1.2 藥物處理 10日齡雞胚隨機(jī)分組，每組10只，在照卵燈下觀測(cè)，然后在距胚頭前1 cm、兩條卵黃靜脈之間的卵殼投影部位，用鉛筆畫出相對(duì)無血管區(qū)。用0.1%新潔爾滅擦拭雞胚蛋殼，在雞胚氣室處鉆一小孔，負(fù)壓吸引，使窗口處形成人工氣室。在已標(biāo)記無血管處的蛋殼表面鉆孔，輕輕去除蛋殼及殼膜，暴露CAM。用鑷子夾取待試藥物濾紙片放在CAM上（加藥面向下），醫(yī)用膠布密封窗口，放入孵育箱37℃繼續(xù)孵化2 d，揭開封口膠布，按照朱國(guó)福等［7］的方法對(duì)CAM進(jìn)行處理和結(jié)果判斷。10個(gè)經(jīng)12a紙片處理的CAM血管生成抑制率＝［（＋）＋（＋＋）］／10。

1.2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖和血管形成實(shí)驗(yàn) 根據(jù)MatrigelTM基質(zhì)用戶手冊(cè)準(zhǔn)備BD Bio-CoatTM血管生長(zhǎng)板。在96孔板上，HUVEC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)到70%～80%滿，胰酶消化后，50μl 4×108細(xì)胞·L－1細(xì)胞懸液接種到包被了Matrigel基質(zhì)的培養(yǎng)板上，在含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)16～18 h。用MTT法測(cè)量12a對(duì)HUVEC生長(zhǎng)的抑制情況，血管生成實(shí)驗(yàn)板用帶數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡觀察并拍照。用MetaMorph軟件系統(tǒng)測(cè)量血管點(diǎn)面積，長(zhǎng)度和分枝點(diǎn)計(jì)算血管形成［8］。結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)，沒有12a而只有PBS和rh-bFGF的孔看做100%，所有實(shí)驗(yàn)濃度至少做4個(gè)重復(fù)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel軟件分析，數(shù)據(jù)用表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a抑制CAM生成

結(jié)果如Fig 1所示，蒸餾水組CAM血管生長(zhǎng)良好，顏色鮮紅，血管分支適中，網(wǎng)絡(luò)清晰，呈葉脈樣放射狀生長(zhǎng)；rh-bFGF對(duì)照組血管生長(zhǎng)更旺盛，密度明顯增大，管徑粗且分支多；12a處理組則大范圍血管明顯褪色，血管密度減少，結(jié)構(gòu)模糊，分支多處斷開。并且隨濃度加大，毛細(xì)血管數(shù)目較對(duì)照組明顯減少，顏色更淺、更蒼白，載體放置的中間部位和周邊幾乎都無血管生成。對(duì)各組的統(tǒng)計(jì)分析表明：0.1μg和1μg 12a對(duì)CAM生成的抑制率分別為60.2%和90.3%。顯然，大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a能明顯抑制新生血管生成。

2．2 大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a抑制HUVEC增殖和血管形成 在 Fig 2，1 mg·L－1和10 mg·L－1的12a能明顯抑制HUVEC的體外增殖（P＜0.01），其IC50接近1mg·L－1。和CAM血管生成抑制試驗(yàn)以及HUVEC的體外增殖結(jié)果相一致，12a能明顯抑制HUVEC在96孔板上形成血管環(huán)，與對(duì)照組相比，在1 mg·L－1時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞簇集和血管形成明顯降低，在10 mg·L－1時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞血管環(huán)形成幾乎完全消失。因此，大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a能明顯抑制血管生成。

3 討論

癌細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)都依賴新生血管的生成［9］。因此，抗血管生成因子很有可能被研發(fā)成優(yōu)良的抗腫瘤藥物。血管生成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶–AM法、卵黃囊膜法、鼠皮下氣囊法、微血管密度法、大鼠腸系膜窗血管生成法、動(dòng)物角膜或虹膜內(nèi)移植等。CAM血管生成模型因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料易得、操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)而成為國(guó)內(nèi)外該類研究的最常用方法。但是CAM血管生成模型也存在一些缺陷，如，存在個(gè)體差異，加入載體后可能出現(xiàn)非特異性炎癥和結(jié)果很難精確測(cè)量等。我們?cè)谘芯恐袑?duì)來自同一批，相同孵化條件下的多個(gè)雞胚進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)來減少實(shí)驗(yàn)誤差。處理48 h后，對(duì)照組的CAM血管網(wǎng)絡(luò)清晰可見，生長(zhǎng)良好。而12a處理組則大范圍血管明顯褪色，密度減少，結(jié)構(gòu)模清晰，分支多處斷開。并且隨濃度加大抑制現(xiàn)象更明顯。這些數(shù)據(jù)表明12a對(duì)體內(nèi)血管生成有較好的抑制作用。

Fig 1 Anti-angiogenic effects ofmastoparan-like peptide12a from wasp（Vespa magnifica）venom in CAM sFertilized chick embryoswere incubated under conditions of constant humidity at37℃.On the tenth day，a square window was open in the egg shell and CAMswere treated with（A）water，（B）0.2μg rh-bFGF，（C）0.1μg12a＋0.2μg rh-bFGF，（D，E）1μg12a＋0.2μg rh-bFGF.（F）Statistical analysis of the above treatment.CAMswere examined on day 12.**P＜0.01 vs0.2μg rh-bFGF

Fig 2 Effect of 12a on HUVEC proliferation and angiogenesis（A）Statistical analysis of proliferation and angiogenesis of HUVEC treated by 0，1，10 mg·L－1 12a；（B）Tube formation of HUVEC treated by 0，1，10 mg·L－1 12a，**P＜0.01 vs control

肥大細(xì)胞脫粒肽是蜂毒中重要組分，具有多種生物活性，其活化肥大細(xì)胞后導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放顆粒包含物組胺、5-羥色胺、白三烯、肝素、前列腺素、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等［5－6］，肥大細(xì)胞及其顆粒包含物能加速CAM的正常血管生成［10－12］。因此，我們的試驗(yàn)結(jié)果似乎與其相矛盾。但是肥大細(xì)胞在雞胚發(fā)育10.5 d后才在CAM上出現(xiàn)和在17.5～20 d后才達(dá)到豐盛［13］，并且15 d齡的雞胚的肥大細(xì)胞才對(duì)外界有免疫力，即能分泌顆粒物質(zhì)［14］。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的CAM肥大細(xì)胞沒有活力，大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a對(duì)CAM血管生長(zhǎng)的抑制作用可能與其脫粒肽活性不相關(guān)聯(lián)。在我們過去的研究中12a僅有微弱的溶血活性［2］，因此，12a在目前的實(shí)驗(yàn)濃度下抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖不是由于其毒性作用所致。Ribatti等［11］認(rèn)為CAM內(nèi)主要的促進(jìn)血管生長(zhǎng)因子是纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞因子。在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)組中不加入rh-bFGF，12a對(duì)CAM血管生長(zhǎng)的抑制作用不是很明顯。并且12a對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的抑制能力不如其對(duì)血管環(huán)的形成。因此，我們推測(cè)大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a可能是通過作用于FGF相關(guān)的信號(hào)通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。另外，外源性能神經(jīng)節(jié)苷脂GM1能結(jié)合FGF-2影響血管生成，但是mastoparan能抑制這種結(jié)合［15］。

因此，大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a具有明顯的血管生成抑制活性，其作用機(jī)制尚不清楚，它能否與VEGF、FGF和內(nèi)皮抑素等血管生成相關(guān)的生長(zhǎng)因子發(fā)生作用有待進(jìn)一步探討。但該發(fā)現(xiàn)對(duì)肥大細(xì)胞脫粒肽12a的開發(fā)應(yīng)用有重要意義。因?yàn)橐郧暗难芯恳呀?jīng)表明大胡蜂肥大細(xì)胞脫粒肽12a毒副作用小，安全性好，易于合成和能特異性結(jié)合G蛋白受體等，若能將其開發(fā)為抗血管生成藥物將有著廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Xu X，Yang H，Yu H，etal.Themastoparanogen from wasp［J］.Peptides，2006，27（12）：3053－7.

［2］ Xu X，Li J，Lu Q，et al.Two families of antimicrobial peptides from wasp（Vespa magnifica）venom［J］.Toxicon，2006，47（2）：249－53.

［3］ Yang H，Xu X，Ma D，et al.A phospholipase A1 platelet activator from the wasp venom of Vespa magnifica（Smith）［J］.Toxicon，2008，51（2）：289－96.

［4］ 宋長(zhǎng)城，呂 祥，程彬彬，等.蜂毒素對(duì)人肝癌BEL-7402細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)及腫瘤血管生成的影響［J］.癌癥，2007，26（12）：1315－22.

［4］ Song C C，LüX，Cheng B B，et al.Effects ofmelittin on growth and angiogenesis of human hepatocelluar carcinoma Bel-7402 cell xenografts in nude mice［J］.Chin J Cancer，2007，26（12）：1315－22.

［5］ Song D L，Chang G D，Ho C L，Chang C H.Structural requirements of mastoparan for activation of membrane-bound guanylate cyclase［J］.Eur JPharmacol，1993，247（3）：283－8.

［6］ Todokoro Y，Yumen I，F(xiàn)ukushima K，et al.Structure of tightly membrane-bound mastoparan-X，a G-protein-activating peptide，determined by solid-state NMR［J］.Biophys J，2006，91（4）：1368－79.

［7］ 朱國(guó)福，張慧卿，侯愛君，等.雷公藤化合物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2007，5（5）：517－20.

［7］ Zhu G F，Zhang H Q，Hou A J，etal.Effectsof three compounds extracted from Tripterygium wilfordiiHook on angiogenesis in chick chorioallantoic membrane［J］.J Chin Integr Med，2007，5（5）：517－20.

［8］ Dasgupta P，Sun J，Wang S，etal.Disruption of the Rb-Raf-1 interaction inhibits tumor growth and angiogenesis［J］.Mol Cell Biol，2004，24（21）：9527－41.

［9］ Folkman J.Tumor angiogenesis：therapeutic implications［J］.N Engl JMed，1971，285（21）：1182－6.

［10］Rizzo V，DeFouw D O.Mast cell activation accelerates the normal rate of angiogenesis in the chick chorioallantoic membrane［J］.Microvasc Res，1996，52（3）：245－57.

［11］Ribatti D，Crivellato E，Candussio L，et al.Mast cells and their secretory granules are angiogenic in the chick embryo chorioallantoic membrane［J］.Clin Exp Allergy，2001，31（4）：602－8.

［12］Ribatti D，Crivellato E，Candussio L，etal.Angiogenic activity of ratmast cells in the chick embryo chorioallantoic membrane is down-regulated by treatmentwith recombinant human alpha-2a interferon and partly mediated by fibroblast growth factor-2［J］.Haematologica，2002，87（5）：465－71.

［13］Andrew A，Rawdon B B.The embryonic origin of connective tissuemast cells［J］.JAnat，1987，150：219－27.

［14］Solomon J B.Actively acquired transplantation immunity in the chick embryo［J］.Nature，1963，198：1171－3.

［15］RusnatiM，Tanghetti E，Urbinati C，et al.Interaction of fibroblast growth factor-2（FGF-2）with free gangliosides：biochemical characterization and biological consequences in endothelial cell cultures［J］.Mol Biol Cell，1999，10（2）：313－27.