阿魏酸預(yù)處理對(duì)阿霉素誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

吳枝娟，余 靖，王瑞幸，方秋娟，林默君

(福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，福建福州 350108)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是臨床常用的蒽環(huán)類廣譜抗腫瘤藥，廣泛用于急性白血病、乳腺癌、胃癌等多種惡性血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤的治療。然而，DOX可造成不可逆的心肌損傷和心力衰竭，且無有效的防治措施，嚴(yán)重限制了 DOX的臨床應(yīng)用［1］。因此，尋找高效低毒且不影響DOX抗腫瘤作用的心臟保護(hù)劑，是DOX化療中急待解決的問題。DOX心臟毒性的機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)有研究顯示，DOX誘發(fā)的氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡是心肌損傷的主要機(jī)制［2］。

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)化學(xué)名稱為4-羥-3-甲氧基肉桂酸，是阿魏、當(dāng)歸、川芎等多種中藥的有效成分。FA具有抗血小板凝集、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，同時(shí)毒性很低［3－4］。近年來，F(xiàn)A的心臟保護(hù)作用日益受到關(guān)注。大量文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)A可以減輕缺血/再灌注、鐵過載等引起的心臟損傷。FA具有很強(qiáng)的抗氧化能力，可以清除自由基，減少心肌細(xì)胞凋亡［5－7］。但FA對(duì)DOX心肌損傷的作用未見相關(guān)報(bào)道。本文通過研究FA對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響，為FA防治DOX心臟毒性提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 H9c2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞株、SGC-7901人胃癌細(xì)胞株、HL-60人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株、MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。注射用鹽酸阿霉素，深圳萬樂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):1309E1。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)購自西安森卓生物科技有限公司，批號(hào):SZ20140115。以注射用生理鹽水配成1 mmol·L－1DOX和25 mmol·L－1FA儲(chǔ)備液，－20℃保存，臨用前稀釋至所需濃度。高糖DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司。caspase-3、Bax、Bcl-2抗體購自 Santa Cruz公司。吖啶橙(acridine orange，AO)、溴化乙錠(ethidium bromide，EB)購自 Sigma-Aldrich公司。肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 H9c2、SGC-7901、MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)0.05、飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁80%時(shí)，胰酶消化、計(jì)數(shù)、傳代，每2～3天傳代1次。取接種24 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)Control、DOX和FA 10、FA 20、FA 40 預(yù)處理(Pre-treated)及共處理(Co-treated)組。對(duì)照組和DOX組分別加入相應(yīng)溶劑和 1 μmol· L－1DOX 培養(yǎng) 24 h;FA 10、FA 20、FA 40 預(yù)處理組加入10、20、40 μmol· L－1FA 預(yù)處理2 h后，再加入DOX共培養(yǎng)24 h;共處理組加入10、20、40 μmol· L－1FA 與 DOX 共培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生存率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×107·L－1細(xì)胞濃度接種96孔板，各實(shí)驗(yàn)組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)無細(xì)胞培養(yǎng)液孔為空白對(duì)照。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，處理結(jié)束后每孔加入10 μl CCK-8工作液。37℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀(Elx800，BioTek，USA)記錄450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。取4孔光密度(optical density，OD)的平均值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:生存率/%=(OD處理組－OD空白組)/(OD對(duì)照組－OD空白組)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 培養(yǎng)液 CK、LDH 及細(xì)胞裂解液 MDA、SOD測(cè)定 取各處理組培養(yǎng)液上清和細(xì)胞裂解液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按試劑盒說明書分別測(cè)定活性和含量。

1.2.4 DCF-DA熒光檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧變化 按照活性氧檢測(cè)試劑盒說明書操作。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至 2 ×109·L－1，加入 10 μmol·L－1DCFDA，37℃孵育20 min，無血清培養(yǎng)液洗去未結(jié)合DCF-DA，每個(gè)樣品收集1×104個(gè)細(xì) 胞，流式細(xì)胞儀 (FACSVerseflow cytometry， BD Biosciences，USA)檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算 DCF-DA標(biāo)記陽性細(xì)胞百分率。

1.2.5 AO-EB染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各處理組細(xì)胞，AO/EB染液孵育10 min，封片后在熒光顯微鏡(IX70-S8F2，Olympus，Japan)下觀察?？梢?種細(xì)胞:活細(xì)胞(VN)，核染色質(zhì)被AO染成綠色并呈正常結(jié)構(gòu);早期凋亡細(xì)胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色并呈固縮狀或圓珠狀;晚期凋亡細(xì)胞(NVA)，膜受損，核染色質(zhì)被EB染成桔紅色并呈固縮或圓珠狀;壞死細(xì)胞(NVN)，膜受損，核染色質(zhì)被EB染成桔紅色并呈正常結(jié)構(gòu)。鏡下隨機(jī)取3個(gè)視野，分類計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，凋亡率/%=(VA+NVA)/(VN+NVN+VA+NVA)×100%。

1.2.6 DNA瓊脂糖凝膠電泳 各處理組收集1×106細(xì)胞，用 PBS洗兩次，加入50 μl細(xì)胞裂解液(200 mmol·L－1Tris-HCl pH=7.5，1 g·L－1NP-40，20 mmol·L－1EDTA)和終濃度0.5 g·L－1蛋白酶K，50℃溫育4 h。不含DNA酶的200 mg·L－1RNaseA，37 ℃消化2 h。離心去沉淀，取15 μl樣品與2.5 μl上樣緩沖液混和，上樣于1.5%0.5 ×TBE的瓊脂糖凝膠(含0.5 mg·L－1EB)樣品槽上。100 V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc 2000，Bio-Rad，USA)成像。

1.2.7 Western blot測(cè)定 caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白

收集H9c2細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌3次，RIPA全細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。等量總蛋白SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印至 PVDF膜。50 g·L－1脫脂奶粉封閉 1 h，caspase-3、Bax、Bcl-2一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色。Image Quant LAS 4000 mini系統(tǒng)成像，Quantity One軟件灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 FA預(yù)處理提高 H9c2細(xì)胞生存率 運(yùn)用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生存率。如Fig 1A所示:DOX可劑量依賴性地降低 H9c2 細(xì)胞生存，0.5、1、2 μmol·L－1DOX處理24 h細(xì)胞生存率分別為(92.37±3.73)%、(78.16±1.68)%、(71.06±2.69)%。根據(jù)以上結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［8］，以 1 μmol·L－1DOX處理24 h建立H9c2細(xì)胞損傷模型。

以前期預(yù)實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，參考FA臨床常用劑量的血藥濃度范圍，選取 10、20、40 μmol·L－13 個(gè)劑量濃度的FA處理DOX損傷的H9c2細(xì)胞，觀察FA對(duì)DOX心肌損傷的作用。結(jié)果顯示:10、20、40 μmol·L－1FA單用不影響H9c2細(xì)胞生存率(P＞0.05)(Fig 1B)。FA預(yù)處理和共處理均使細(xì)胞生存率有不同程度提高。FA預(yù)處理組細(xì)胞生存率均高于相同劑量FA共處理組，其中低、中劑量組差別有顯著性(P＜0.05，Pre-treatedvsCo-treated)。20、40 μmol·L－1FA預(yù)處理組細(xì)胞生存率為(96.95±6.33)%和(99.24±4.98)%，較DOX損傷組明顯升高(P＜0.05)，且接近正常水平(P＞0.05vsControl)。以上結(jié)果說明:FA預(yù)處理的保護(hù)作用優(yōu)于共處理，值得進(jìn)一步研究。

Fig 1Effect of FA on cell viability of H9c2 cells(±s，n=3)

2.2 FA預(yù)處理減輕H9c2細(xì)胞損傷

2.2.1 FA逆轉(zhuǎn)DOX誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化如Fig 2所示，倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):正常H9c2細(xì)胞呈梭形，排列規(guī)整，大小均一，胞核、胞質(zhì)境界清楚。DOX損傷組細(xì)胞大小不規(guī)則，胞體變圓、皺縮，胞核增大，胞質(zhì)有空泡出現(xiàn)。FA預(yù)處理組細(xì)胞大小較為均一，形態(tài)趨向正常，細(xì)胞皺縮變形和胞質(zhì)空泡化減少。

Fig 2 Effect of FA on morphology of H9c2 cells injured by DOX(×200)

2.2.2 FA減少H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液LDH、CK釋放量

與對(duì)照組比較，DOX損傷組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH和CK的含量升高了65.43%和95.77%(P＜0.01)。FA預(yù)處理組細(xì)胞培養(yǎng)液LDH和CK的含量有所降低，高劑量FA預(yù)處理組LDH和CK含量較DOX損傷組降低了23.57%和31.42%，差異有顯著性(P＜0.05)。

Tab 1 Effect of FA on LDH and CK levels in cultured fluid of DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

Tab 1 Effect of FA on LDH and CK levels in cultured fluid of DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05 vs DOX.

Group LDH/U·L－1 CK/U·L －1 Control 25.83 ±3.21 2.13 ±0.18 DOX 42.73 ±7.47## 4.17 ±0.62##FA 10 μmol·L －1 40.27 ±6.49# 3.77 ±0.47##FA 20 μmol·L －1 38.36 ±6.45# 3.12 ±0.31#*FA 40 μmol·L －1 32.66 ±5.21#* 2.86 ±0.25#*

2.3 FA預(yù)處理抑制DOX誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

2.3.1 FA減少活性氧生成 DCF-DA熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)比較各處理組細(xì)胞活性氧(reactive oxy-gen species，ROS)含量。結(jié)果如 Fig 3 所示，1 μmol·L－1DOX處理24 h使DCF-DA陽性率由(30.29±2.87)%升高至(47.51±2.41)%。FA預(yù)處理可對(duì)抗 DOX 誘導(dǎo)的 ROS 增多。10、20、40 μmol·L－1FA處理組DCF-DA陽性率降低至(39.77±2.69)%、(38.19±3.02)%和(34.59±2.62)%(P＜0.05vsDOX損傷組)。

Fig 3 FA inhibits ROS generation induced by DOX in H9c2 cells(±s，n=3)

2.3.2 FA降低DOX損傷H9c2細(xì)胞MDA水平，增加SOD活性 DOX損傷組細(xì)胞內(nèi)MDA水平升高，而SOD活性降低(P＜0.05)。與DOX損傷組比較，低、中、高劑量FA預(yù)處理組MDA含量分別降低6.77%、26.99%和33.92%(P＜0.05);中、高劑量FA處理組SOD活性升高24.94%和21.32%(P＜0.05)。

2.4 FA預(yù)處理抑制DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

2.4.1 FA減少心肌細(xì)胞凋亡 AO-EB熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果如Fig 4所示:對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為(2.43±0.52)%;DOX損傷組凋亡率明顯升高，達(dá)(21.81±3.17)%(P＜0.01);低、中、高劑量FA預(yù)處理組，細(xì)胞凋亡率逐漸降低。中、高劑量FA預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率較DOX損傷組降低45.76%和53.65%(P＜0.05)。

Fig 4 Effect of FA on apoptosis induced by DOX in H9c2 cells(±s，n=3)

2.4.2 FA減輕DNA片段化 細(xì)胞凋亡的主要生化特征是DNA片段化。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如Fig 5所示:DOX損傷組呈現(xiàn)凋亡特征性梯狀圖譜(DNA ladder)。FA預(yù)處理減輕DOX誘導(dǎo)的DNA片段化。10 μmol·L－1FA處理組仍可見較為清晰的 DNA ladder，20 和 40 μmol·L－1FA 處理組未檢到典型的DNA ladder。

Tab 2 Effect of FA on MDA and SOD in DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

Tab 2 Effect of FA on MDA and SOD in DOX-injured H9c2 cells(±s，n=3)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs DOX.

Group MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro Control 33.64 ±5.93 47.38 ±3.52 DOX 64.29 ±6.82## 31.83 ±4.38#FA 10 59.94 ±3.37##* 30.28 ±2.15#FA 20 46.94 ±7.52#* 39.73 ±3.26#*FA 40 42.48 ±4.97#＊＊ 38.58 ±2.97#*

Fig 5 Agarose gel electrophoresis analysis of apoptotic DNA fragments

2.4.3 FA 抑制促凋亡蛋白 caspase-3、Bax，增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá) 蛋白免疫印跡結(jié)果如Fig 6所示:1 μmol·L－1DOX 處理 24 h，促凋亡蛋白caspase-3和 Bax含量分別增加61.88%和150.91%;抑凋亡蛋白Bcl-2含量則減少63.04%(P＜0.01)。FA預(yù)處理可以抑制上述改變。與DOX損傷組比較，中劑量FA預(yù)處理使caspase-3和Bax減少21.19%和49.51%，Bcl-2增加67.36%(P＜0.05vsDOX);高劑量FA預(yù)處理caspase-3和Bax減少34.75%和63.52%，Bcl-2增加137.20%(P＜0.01vsDOX)。

2.5 FA預(yù)處理不影響DOX對(duì)HL-60、SGC-7901、MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)A具有抗腫瘤作用［9］，但在本研究的心肌保護(hù)劑量范圍內(nèi)，F(xiàn)A預(yù)處理是否影響DOX抗腫瘤作用還需要實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究選用3種對(duì)DOX敏感的人腫瘤細(xì)胞株(人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株)觀察FA對(duì)DOX抗腫瘤作用的影響。如Fig 7所示，10、20、40 μmol·L－1FA 預(yù)處理后，與 1 μmol·L－1DOX共培養(yǎng)24 h，細(xì)胞生存率與DOX單用組比較差異無顯著性(P＞0.05)。40 μmol·L－1FA 預(yù)處理，測(cè)定 DOX對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果如Tab 3所示:經(jīng)FA預(yù)處理，DOX對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的IC50無明顯改變(P＞0.05)。

Fig 6 Effects of FA on expression of caspase-3，Bax and Bcl-2 induced by DOX in H9c2 cells(±s，n=3)

Fig 7 Effect of FA on viability of DOX-teated HL-60，SGC-7901，MCF-7 cells(±s，n=3)

3 討論

心臟毒性是DOX最常見和最嚴(yán)重副作用，其機(jī)制尚未完全明確。氧化應(yīng)激是DOX心臟毒性的主要原因。DOX在心肌細(xì)胞代謝過程中，產(chǎn)生大量活性氧，消耗內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，造成心肌細(xì)胞膜系統(tǒng)的脂質(zhì)過氧化，引發(fā)一系列的生化及病理變化，導(dǎo)致心肌損傷［10］。心肌細(xì)胞凋亡是DOX心臟毒性的另一重要機(jī)制。DOX激活細(xì)胞凋亡通路，引起心肌細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn):凋亡造成心肌細(xì)胞丟失，與DOX心臟毒性的心肌收縮功能障礙和心功能衰竭關(guān)系密切［11］。

Tab 3 Effect of FA on DOX's antineoplastic activity against human tumor cell lines(±s，n=3)

Tab 3 Effect of FA on DOX's antineoplastic activity against human tumor cell lines(±s，n=3)

Cells were pre-treated with 40 μmol·L －1FA for 2 h prior to DOX exposure

Cell line IC50of DOX/μmol·L －1 DOX FA+DOX HL-60 0.28 ±0.08 0.31 ±0.12 SGC-7901 7.24 ±0.66 6.93 ±0.44 MCF-7 5.87 ±0.82 6.14 ±0.59

本研究利用DOX誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，評(píng)估FA對(duì)DOX心肌損傷的保護(hù)作用。DOX使H9c2細(xì)胞生存率降低、形態(tài)改變、心肌酶外漏，引起嚴(yán)重的心肌損傷。FA預(yù)處理則可提高細(xì)胞生存率，使細(xì)胞形態(tài)趨向正常，LDH和CK外漏減少。CK是特異性心肌標(biāo)志物，LDH是細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定存在的酶類。心肌細(xì)胞受損時(shí)，CK和LDH釋放入培養(yǎng)液，其漏出量反映細(xì)胞膜損傷程度。FA預(yù)處理減少了DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CK、LDH漏出，說明心肌細(xì)胞膜損傷有所減輕。此外，經(jīng)FA預(yù)處理DOX對(duì)人早幼粒細(xì)胞白血病HL-60細(xì)胞株、人胃癌SGC-7901細(xì)胞株、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50)無明顯改變，說明在上述心肌保護(hù)劑量范圍內(nèi)FA不影響DOX的抗腫瘤作用。FA預(yù)處理可以減輕DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷，同時(shí)又不影響DOX的抗腫瘤活性，有可能應(yīng)用于DOX化療的心肌保護(hù)，其心肌保護(hù)的機(jī)制值得深入研究。

FA是天然抗氧化劑，其分子結(jié)構(gòu)中酚醛核及不飽和側(cè)鏈可以很容易地形成共軛穩(wěn)定的苯氧自由基，因此具有很強(qiáng)的清除活性氧的能力［12］。DOX損傷組細(xì)胞DCF-DA熒光強(qiáng)度和MDA水平升高。DCF-DA是活性氧的指示劑，MDA是生物體脂質(zhì)氧化的天然產(chǎn)物。細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量的MDA。FA預(yù)處理使DCF-DA熒光強(qiáng)度和MDA水平降低，說明FA可以清除活性氧，減輕脂質(zhì)過氧化，對(duì)抗DOX引起的氧化應(yīng)激，減輕細(xì)胞損傷。心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶是維持心肌細(xì)胞的氧化與抗氧化平衡的重要因素。由于心肌細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化酶含量較少，發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)難以及時(shí)清除活性氧，造成氧化和抗氧化失平衡，使心肌細(xì)胞易受到氧化應(yīng)激損傷［13］。DOX不僅誘導(dǎo)了活性氧生成和脂質(zhì)過氧化，還能抑制心肌細(xì)胞抗氧化酶活性，破壞心肌細(xì)胞正常的氧化 －抗氧化平衡，導(dǎo)致細(xì)胞損傷［14］。超氧化物歧化酶(SOD)是心肌細(xì)胞的主要抗氧化酶。本實(shí)驗(yàn)中，DOX損傷組SOD活性明顯降低，心肌細(xì)胞抗氧化能力減弱。FA預(yù)處理使SOD活性增高，心肌抗氧化能力增強(qiáng)，則有助于恢復(fù)心肌細(xì)胞氧化－抗氧化平衡。

本實(shí)驗(yàn)中，AO-EB染色和DNA瓊脂糖凝膠電泳均證明DOX引起H9c2心肌細(xì)胞凋亡。FA預(yù)處理減少DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為凋亡特征性的DNA片段化減輕，細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性降低。蛋白免疫印跡顯示，DOX損傷H9c2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白caspase-3和Bax表達(dá)增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)減少，上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［15－16］。Bax是 Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，細(xì)胞受到損傷時(shí)，Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體表面，增加線粒體通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C外漏，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑。Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，阻止Bax向線粒體移位，拮抗 Bax的促凋亡作用。caspase-3是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。凋亡早期caspase-3活化(active casapse-3)，裂解相應(yīng)胞質(zhì)胞核底物，切割核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡。FA可調(diào)節(jié)上述凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。FA預(yù)處理降低DOX損傷心肌細(xì)胞促凋亡蛋白Bax和caspase-3含量，同時(shí)增加Bcl-2的表達(dá)，抑制DOX的促凋亡作用。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn) FA提高DOX損傷H9c2大鼠心肌細(xì)胞的生存率，減輕心肌損傷，具有一定的心肌保護(hù)作用。FA可清除DOX產(chǎn)生的活性氧，增加心肌SOD酶活性，降低細(xì)胞MDA含量，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。FA抑制促凋亡蛋白caspase-3、Bax，增加抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，減少DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。FA對(duì)DOX心肌損傷的保護(hù)作用可能與抗氧化應(yīng)激和抗心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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