ERCC1新抗體在非小細胞肺癌鉑類用藥分子診斷中的應用

羅靜 徐美青 郭明發(fā) 魏大中 柳常青 孫翔翔

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院胸外科，安徽 合肥 230001

肺癌是目前我國發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，約80%診斷為非小細胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)。手術(shù)是Ⅰ～Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者主要的治療方法之一，雖術(shù)后予以輔助化療，但生存率改善不佳，有研究表明5年生存率僅改善5%［1-2］，近年來，隨著肺癌個體治療的發(fā)展，為肺癌患者選擇合適的化療方案，從而提高療效，延長生存期。DNA切除修復交叉互補基因1 (excision repair cross complementation group l，ERCC1)蛋白在DNA修復途徑中起關(guān)鍵作用，其高表達與鉑類藥物的耐藥性相關(guān)。以往研究中常采用抗體8F1檢測ERCC1的表達，研究結(jié)果有正向的，也有反向的［3-4］。近來發(fā)現(xiàn)ERCC1抗體8F1有非特異性，同時也研制了ERCC1的新抗體4F9［5-6］。但該新抗體用于腫瘤臨床標本的檢測進而指導鉑類用藥的研究鮮見報道。為了明確ERCC1新抗體4F9在NSCLC患者鉑類用藥的指導作用，本研究采用ERCC1新抗體4F9免疫組化方法檢測ERCC1在NSCLC組織中的表達，分析其與NSCLC臨床和病理特征的關(guān)系，以及鉑類化療藥物對患者的療效和生存期的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2010年6月—2011年1月安徽省立醫(yī)院胸外科手術(shù)治療且術(shù)后行輔助化療的Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者72例，其中男性42例，女性30例，年齡40～72歲；鱗癌38例，腺癌34例；臨床Ⅰ期為30例，Ⅱ期為28例，Ⅲ期為14例；淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移為32例，有轉(zhuǎn)移為40例。采用GP方案(吉西他濱1 g/m2第1、8天+卡鉑500 mg/m2)者24例，采用TP方案(多西他賽100 mg/m2+卡鉑500 mg/m2)者32例，采用NP方案(長春瑞濱25 mg/m2第1、5天+卡鉑500 mg/m2)者16例，連續(xù)4～6個周期。患者自手術(shù)后開始隨訪，末次隨訪時間至2013年7月30日。

1.2 實驗步驟

取上述72例患者手術(shù)標本，經(jīng)石蠟包埋，4 μm切片；經(jīng)二甲苯，無水酒精脫蠟，水化組織切片；抗原修復暴露抗原決定族；3%H2O2處理內(nèi)源性過氧化物酶10 min；封閉非特異，PBS洗3次，每次3 min；一抗ERCC1抗體克隆4F9(購自北京中衫公司，1∶100稀釋)，放入濕盒中于37 ℃ 1 h或4 ℃過夜溫育，PBS洗3次，每次3 min；二抗(購自福州邁新公司，按說明書稀釋)溫育30 min，PBS洗3 min×5次；SP(購自福州邁新公司，按說明書稀釋)37 ℃溫育30 min；DAB顯色系統(tǒng)顯色，加滴蘇木素染液復染后脫水、封片。

判定標準：采用組織化學評分法，采取10個高倍視野，計數(shù)腫瘤細胞的陽性比例，腫瘤細胞表達數(shù)1%～9%計分0.1；>9%～49%計分0.5；>49%計分1，并根據(jù)陽性細胞染色強度記分(0、1、2、3分)，二者分數(shù)相乘為該標本的最終得分?！?為高表達，<1為低表達。

1.3 預后評價

化療療效按RECIST 1.1標準評價，計算化療有效率。計算中位生存期及2年生存率，生存期為治療開始至死亡或隨訪結(jié)束的時間。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用χ2檢驗，以Kaplan-Meier法進行生存分析，采用Log-rank比較生存率，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 ERCC1表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化檢測結(jié)果顯示，ERCC1蛋白陽性表達的NSCLC細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(圖1)，72例NSCLC患者中ERCC1高表達為55.5%(40/72)。χ2檢驗顯示，ERCC1表達與年齡、性別、期別、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 免疫組化檢測ERCC1在NSCLC中表達Fig. 1 ERCC1 expression detected by immunohistochemistry in NSCLC(DAB,×200)

表1 ERCC1表達與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 Tab. 1 Correlation between the expression of ERCC1 with the clinicopathological characteristics of NSCLC

2.2 ERCC1的化療有效率

ERCC1高表達患者的化療有效率為37.5%，低表達者為62.5%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036，表2)。

2.3 ERCC1表達與生存期之間的關(guān)系

在40例ERCC1高表達患者中，中位總生存期為18.4個月，2年生存率為37.5%，32例ERCC1低表達的患者中，中位總生存期為22.9個月，2年生存率為46.9%，ERCC1低表達患者中位總生存期明顯長于ERCC1高表達患者(P=0.046，圖2)。Ⅰ期ERCC1高表達和低表達患者的中位生存期分別是32.4個月和31.1個月，Ⅱ期ERCC1低表達患者和高表達患者的中位生存期分別是24.6個月和21.5個月，Ⅲ期ERCC1低表達患者和高表達患者的中位生存期分別是18.4個月和14.3個月，Ⅱ期和Ⅲ期ERCC1陰性中接受鉑類藥物化療的患者的中位生存期明顯長于陽性患者。

表2 ERCC1的表達與化療有效率Tab. 2 The Chemotherapy effi ciency related with ERCC1 expression

圖2 ERCC1表達與總體生存期的關(guān)系Fig. 2 Kaplan-Meier plot of overall survival of NSCLC according to ERCC1 expression

3 討 論

目前肺癌術(shù)后治療以化療為主，因患者個體間的差異、分子病理類型的不同，肺癌患者對標準化療敏感性差異較大。因此近年來提出了針對不同患者進行個體化治療的概念。通過檢測藥物靶標基因表達，制定個體化治療方案，從而提高化療效果，并判定預后。

ERCC1位于染色體l9ql3.2-13.3，全長15 kb，含l0個外顯子，被轉(zhuǎn)錄加工為1.0 kb mRNA和1.1 kb mRNA，僅后者編碼含297個氨基酸的蛋白質(zhì)，是首個克隆的DNA損傷修復基因［7］，是DNA損傷修復途徑中最主要的基因之一，具有損傷識別和切除5’端的雙重作用，在核苷酸切除修復中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用，是DNA修復的一個重要途徑。鉑類藥物抗腫瘤作用的主要靶點為DNA，其細胞毒性主要在于與細胞核DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，影響DNA復制轉(zhuǎn)錄，導致其致命損傷。ERCC1作為核苷酸切除修復的限速酶參與DNA的修復并且有可能作為使用鉑類化療藥的預測的標志物［8］，目前針對NSCLC的一線化療方案是以鉑類為主的聯(lián)合化療。Simon等［3］和Sarrier等［9］根據(jù)ERCC1表達水平預測鉑類的療效，結(jié)果表明ERCC1低表達者用鉑類治療，ERCC1高表達者用非鉑類治療，可以提高NSCLC治療的有效率。Cobo等［10］的研究是第一次根據(jù)ERCC1 mRNA表達水平進行選擇性應用鉑類藥物的Ⅲ期對照試驗，結(jié)果提示，依據(jù)ERCC1 mRNA表達水平對順鉑進行選擇性用藥好于非選擇順鉑/多西他賽的傳統(tǒng)治療，實驗組客觀緩解率、無進展生存期均高于對照組。但也有相反的研究結(jié)果，Bepler等［4］報道了依據(jù)ERCC1和RRM1表達水平選擇用藥的Ⅲ期前瞻性研究結(jié)果，檢測的實驗組(根據(jù)檢測用藥)與無檢測的對照組(用吉西他濱/卡鉑方案)在無病生存期上差異無統(tǒng)計學意義。但進一步分析卻發(fā)現(xiàn)，在實驗組和對照組中，ERCC1/RRM1均為表達低的患者都用了吉西他濱/卡鉑治療在無病生存期上差異有統(tǒng)計學意義。這些患者無論是分在實驗組還是對照組，其無病生存期理應沒有差異。因為其ERCC1/RRM1均為表達低、且均使用了吉西他濱/卡鉑治療，可以將他們看作是實驗中的內(nèi)對照?；诒臼菬o差異的內(nèi)對照卻出現(xiàn)了有差異的情況，筆者認為該結(jié)果(檢測的實驗組與無檢測的對照組在無病生存期上的差異無統(tǒng)計學意義)是假陰性，并分析了造成此結(jié)果的原因：①多單位間在收集標本和處理標本的差異；②所用的檢測ERCC1的抗體8F1存在問題；③以往多采用批量處理標本，而該研究采用即時處理標本，也可造成結(jié)果的差異。

已發(fā)現(xiàn)ERCC1抗體8F1存在非特異性，除了ERCC1蛋白外，還識別細胞核膜蛋白PCYT1A［5-6］。為解決這一問題，有研究者制備了ERCC1的新抗體，4F9是其中之一［6］。但4F9應用于腫瘤臨床標本的研究鮮見報道［5］。本研究采用ERCC1新抗體4F9免疫組化方法檢測ERCC1在NSCLC腫瘤組織中的表達，分析其與NSCLC臨床和病理特征的關(guān)系，以及對患者鉑類化療療效和生存期的影響。發(fā)現(xiàn)ERCC1蛋白低表達的患者中位生存期及2年生存率明顯好于高表達者(P<0.05)，表明ERCC1新抗體4F9免疫組化檢測對預測鉑類化療療效的可行性。

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