替米沙坦激活PPARγ改善衰老大鼠腦血管內(nèi)皮依賴性舒張功能

張黎黎，楊震，劉愛(ài)東，黃鳴清，周鵬，王沛堅(jiān)＊

（1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，成都 610500；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122）

目前我國(guó)超過(guò)60歲的老齡人口約2億，提示我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老齡化社會(huì)。年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致血管老化是心腦血管疾病如腦卒中、冠心病、高血壓等的重要危險(xiǎn)因素［1，2］。血管老化最初的特征主要表現(xiàn)為血管內(nèi)皮功能障礙［3］。由于血管老化往往缺乏典型的臨床癥狀，目前對(duì)老年人群?jiǎn)渭兊难芾匣F(xiàn)象并未引起足夠重視，缺少相應(yīng)的防治措施［1］。此外，我國(guó)老年人口高血壓的患病率已高達(dá)49%［4］，因此尋求既能降低血壓又能改善血管功能，防止血管老化的藥物顯得尤為重要。

替米沙坦為血管緊張素II受體（AT1型）拮抗劑，是臨床常用的降壓藥物，可改善高血壓患者預(yù)后。但近年研究顯示，替米沙坦不但可拮抗AT1受體，還可作為過(guò)氧化物酶增殖物受體γ（PPARγ）和過(guò)氧化物酶增殖物受體β（PPARβ）的激動(dòng)劑。替米沙坦通過(guò)激活PPARγ具有改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的作用［5，6］；通過(guò)激活PPARβ具有改善高脂喂養(yǎng)小鼠的胰島素抵抗，降低高脂喂養(yǎng)的高血壓大鼠的體質(zhì)量和血壓［7，8］。更為重要的是，替米沙坦還可增加內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮（NO）水平，延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老［9］。目前研究已證實(shí)替米沙坦可降低血壓并防止血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老，但替米沙坦對(duì)衰老相關(guān)的腦血管內(nèi)皮功能障礙的作用及機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)利用自然衰老的大鼠模型，觀察替米沙坦對(duì)衰老大鼠模型血壓、心率及腦動(dòng)脈血管功能的影響，在此基礎(chǔ)上分離腦基底動(dòng)脈，觀察PPARγ和PPARβ的阻斷劑對(duì)替米沙坦作用的影響，從而初步揭示替米沙坦對(duì)衰老大鼠腦動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

24月齡雄性SD大鼠（12只）和6月齡雄性SD大鼠（6只）［1］，分為年輕對(duì)照組（6只）、衰老模型組（6只）、衰老－替米沙坦組（6只，灌胃給藥，5mg／kg／d）。替米沙坦以生理鹽水混懸后灌胃給藥，衰老組和對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃，1次／d，干預(yù)時(shí)間為1月。

1.2 儀器及試藥

1.2.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱 （TC2323型，SHELDON，USA）；去離子水過(guò)濾器 （Millipore，德國(guó)）；PH 計(jì)（ф320 型，Beckman，德國(guó)）；多導(dǎo)電生理記錄儀 （Powerlab／8SP，ADI，Australia）；微血管張力測(cè) 定 儀 （Wire Myograph，DMT 620M 型，Denmark）。

1.2.2 試藥 替米沙坦（上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、抗生素、胎牛血清等購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；烏拉坦 （上海SCRC國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；氯化鉀 （KCl，重慶北碚化學(xué)試劑廠）；GSK0660、GW9662、二甲基亞砜（DMSO）、L－硝基－精氨酸甲脂（L－NAME）、5－羥色胺（5－HT）、乙酰膽堿 （Ach）均購(gòu)于Sigma公司；硝酸甘油 （NTG，山西康寶生物制品股份有限公司）。

1.3 腦基底動(dòng)脈的體外培養(yǎng)［1，10］

SD大鼠以10%烏拉坦腹腔注射麻醉后斷頭處死，在解剖顯微鏡下分離腦基底動(dòng)脈，立即轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)放至盛有DMEM培養(yǎng)基的六孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。分組：衰老組，衰老＋替米沙坦（Telmi，10 μM）組，Telmi＋GSK0660 （1μM）組，Telmi＋GW9662（1μM）組，干預(yù)時(shí)間為24h。

1.4 血管功能評(píng)價(jià)

1.4.1 參照既往建立的方法［1，11］在解剖顯微鏡下將血管環(huán)懸于兩根鋼絲之間，血管環(huán)于浴槽中平衡60min并調(diào)初張力致2mN，穩(wěn)定后加入60mM KCl溶液預(yù)激3次，開(kāi)始以下實(shí)驗(yàn)：1）內(nèi)皮依賴性舒張功能（endothelium dependent relaxation，EDR）評(píng)估：于浴槽加入5－HT （10－5mmol／L）收縮血管，血管張力達(dá)平臺(tái)后分別加入不同濃度的Ach（10－9～10－5mmol／L），觀察血管對(duì) Ach的反應(yīng)性，每一濃度的加入均在上一濃度的反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)后加入。2）非內(nèi)皮依賴性 舒張 功能的評(píng)估：以5－HT （10－5mmol／L）預(yù)收縮血管，待反應(yīng)達(dá)平臺(tái)后加入不同濃度的 NTG （10－9～10－5mmol／L），觀察血管對(duì) NTG的反應(yīng)性，每一濃度的加入均在上一濃度的反應(yīng)到達(dá)平臺(tái)后加入。

1.4.2 舒張反應(yīng)的計(jì)算方法 Ach或NTG所引起的最大舒張幅度與5－HT引起的最大收縮幅度之比值。將數(shù)據(jù)輸入Prism 3.0軟件，制作擬合曲線，通過(guò)軟件計(jì)算最大舒張反應(yīng)［Emax（%）］，并進(jìn)行組間比較。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，Prism 3.0軟件制圖，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦對(duì)衰老大鼠模型血壓、心率的影響

衰老大鼠（24月齡）模型的血壓、心率與對(duì)照組大鼠（6月齡）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；替米沙坦（5mg／kg／d）灌胃給藥對(duì)血壓和心率無(wú)顯著影響，組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見(jiàn)圖1A和圖1B）。

2.2 PPARγ和PPARβ阻斷劑對(duì)替米沙坦作用的影響

替米沙坦（Telmi，10μM，24h）孵育可顯著改善衰老大鼠腦動(dòng)脈EDR，與衰老組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。PPARγ的阻斷劑 GW9662（1 μM，24h）可顯著阻斷替米沙坦對(duì)EDR的改善作用（P＜0.05）；PPARβ的阻斷劑 GSK0660（1μM，24 h）雖有輕度的減弱作用，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示替米沙坦改善衰老大鼠腦動(dòng)脈EDR的作用依賴于PPARγ（見(jiàn)圖2）。

圖1 替米沙坦對(duì)衰老大鼠模型血壓、心率的影響

2.3 替米沙坦對(duì)自然衰老大鼠模型血管功能的影響

與對(duì)照組大鼠比較，衰老大鼠腦基底動(dòng)脈Ach誘導(dǎo)的EDR顯著下降（P＜0.01），替米沙坦可改善衰老大鼠腦動(dòng)脈Ach誘導(dǎo)的EDR（P＜0.05）。但以LNAME（100μM，30min）預(yù)孵后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組大鼠NTG誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張功能比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果提示，替米沙坦可顯著改善衰老大鼠腦基底動(dòng)脈Ach誘導(dǎo)的EDR（見(jiàn)圖3A、圖3B和圖3C）。

圖2 替米沙坦體外孵育對(duì)衰老大鼠EDR的作用及PPARγ和PPARβ阻斷劑的影響與衰老組比較，＊＊P＜0.01；與衰老－替米沙坦組比較，＃P＜0.05

圖3 替米沙坦對(duì)自然衰老大鼠模型血管功能的影響

3 討論

衰老是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素，其主要原因可能與衰老導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平的顯著升高，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損有關(guān)，其機(jī)制可能與活性氧簇（ROS）在衰老的進(jìn)程中顯著升高有關(guān)。ROS不但直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，還通過(guò)失活具有內(nèi)皮保護(hù)作用的舒張因子－NO，直接介導(dǎo)了EDR受損［12］。

目前用于研究衰老的病理生理特征及相關(guān)的干預(yù)策略的動(dòng)物模型主要有D－半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型、自然衰老模型、臭氧吸入制作的自由基損傷模型等［1，13］。通常認(rèn)為自然衰老模型能較好地模擬自然衰老進(jìn)程，其病理特點(diǎn)與人體的衰老較為類似，是目前常用的研究衰老的重要模型［14］。本研究采用24月齡SD大鼠作為研究對(duì)象，衰老SD大鼠血壓和心率與6月齡的對(duì)照大鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往的研究一致。

替米沙坦是臨床常用的抗高血壓藥物，有研究［15］發(fā)現(xiàn)，其還有改善血管內(nèi)皮功能的作用。在本研究中，衰老大鼠在灌胃給予替米沙坦1月后，其腦動(dòng)脈Ach誘導(dǎo)的EDR得到顯著改善，而對(duì)NTG誘導(dǎo)的非內(nèi)皮依賴性舒張功能未見(jiàn)明顯影響。近年研究［7，8］提示，替米沙坦對(duì)肥胖相關(guān)的血壓升高不但具有降壓作用還能改善代謝，包括改善葡萄糖代謝、減輕體質(zhì)量和胰島素抵抗，但上述作用卻不依賴于AT1受體的阻斷作用，而是依賴于PPARβ。另有研究［16，17］顯示，替米沙坦通過(guò)激活 PPARγ具有顯著心血管代謝的保護(hù)作用。為分析替米沙坦對(duì)腦動(dòng)脈EDR改善作用依賴于PPARγ抑或是PPARβ，根據(jù)既往建立的體外培養(yǎng)血管組織的方法，觀察了PPARβ和PPARγ的阻斷劑對(duì)替米沙坦作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPARγ的阻斷劑GW9662可顯著阻斷替米沙坦的作用，而PPARβ的阻斷劑GSK0660則不能，提示替米沙坦改善老齡鼠腦動(dòng)脈EDR依賴于PPARγ。

綜上所述，傳統(tǒng)的降壓藥物替米沙坦不但具有顯著的抗高血壓作用，對(duì)于非高血壓的老齡個(gè)體，替米沙坦則具有改善腦血管內(nèi)皮功能的作用。故推測(cè)對(duì)于老齡高血壓患者，替米沙坦的應(yīng)用可能更有利于預(yù)防腦卒中的發(fā)生，但需進(jìn)一步深入開(kāi)展基礎(chǔ)及臨床研究。

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