海洋天然活性產(chǎn)物Fascaplysin的研究進展

黨柱，朱海靜，焦宇，陸濤*

(1.中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198; 2.中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院，北京 100088)

由于所處異于陸地生物的獨特外界環(huán)境，海洋生物在長期進化過程中能代謝產(chǎn)生一些結(jié)構(gòu)獨特的化學物質(zhì)——次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites)?，F(xiàn)代藥理學研究表明，很多海洋生物（如石房蛤、麝香蛸、?？?、海兔等）的次生代謝產(chǎn)物對人類多種疾病的藥效甚至遠遠超過目前臨床使用的藥物。海綿是一種最低等的多細胞動物，結(jié)構(gòu)較簡單，但作為一個特殊生物群體，其含有極豐富的生物活性物質(zhì)，其中許多具有抗腫瘤活性。

1988年，猶他大學Ireland研究小組和康奈爾大學Clardy研究小組共同發(fā)現(xiàn)并報道了一種從海綿中提取分離得到的紅色活性生物堿Fascaplysin(1)。迄今已發(fā)現(xiàn)該化合物具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗瘧疾、抑制膽堿酯酶等[1-2]。本文對Fascaplysin的抗腫瘤機制、全合成及結(jié)構(gòu)改造的研究進展作一綜述。

1 Fascaplysin的抗腫瘤機制

細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一類促進細胞有絲分裂進程的激酶，在細胞周期中發(fā)揮重要作用，迄今已發(fā)現(xiàn)其有13種亞型[3-7]。近期，維也納大學的Hamilton等[8]在小細胞肺癌細胞株抑制實驗中發(fā)現(xiàn)，CDK抑制劑與喜樹堿衍生物具有協(xié)同作用。CDK4是CDK家族中的一種亞型，在細胞周期G0-G1期中起關(guān)鍵作用，同時對G1/S期也有一定影響，且多項研究表明，抑制CDK4活性，能致使細胞周期停滯[9-11]。哈佛大學醫(yī)學院的Yu等[12]在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，抑制CDK4激酶，對人表皮生長因子受體-2（ErbB-2）過度表達的乳腺癌患者具有顯著療效?；菔瞎狙芯咳藛T的一項研究報告表明，Cyclin D1/ CDK4在MCF-7乳腺癌細胞中的過表達能促進Rb蛋白的磷酸化，并促進細胞周期越過G1/S期，導致細胞增殖[13]。另一項研究還發(fā)現(xiàn)，CDK4抑制劑能增強紫杉醇對肺癌細胞的細胞毒性[14]。因此，CDK4被證實是一個抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的藥物作用靶點。

諾華公司的一項研究表明，F(xiàn)ascaplysin可選擇性抑制 CDK4/Cyclin D1， 其 IC50達 0.35 μmol·L-1(Rajeev等 ,Biochem Biophys Res Commun, 2000年)。Nathaniel等（Tetrahedron Lett, 2003年)進行的實驗研究顯示，F(xiàn)ascaplysin對白血病L1210細胞株的IC50達0.65 nmol·L-1。H?rmann等 (Bioorg Med Chem, 2001年)則研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascaplysin分子的平面結(jié)構(gòu)能非特異性地嵌入DNA結(jié)構(gòu)，從而改變DNA分子的構(gòu)象，抑制基因轉(zhuǎn)錄與復制。此外，F(xiàn)ascaplysin還具有促細胞凋亡和抑制血管生成作用，可抑制小鼠腫瘤細胞和人宮頸癌HeLa 細胞生長[15-17]。Wang等[18]近期又經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ascaplysin能通過上調(diào)促凋亡受體TRAILR2 (DR5)的表達來激活DR5介導的細胞凋亡通路，促進細胞凋亡。所以，目前認為CDK4是Fascaplysin產(chǎn)生抗腫瘤作用的主要靶標。

CDK4的晶體結(jié)構(gòu)已在2009年被確證，但CDK4與Fascaplysin結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)目前還未見報道。Aubry等[19]用數(shù)學建模方法建立了Fascaplysin與CDK4結(jié)合模型：Fascaplysin可嵌入CDK4的ATP結(jié)合口袋中，主要通過氫鍵、庫侖力、π—π 作用、范德華力等方式與CDK4發(fā)生作用，而其結(jié)構(gòu)中的NH和羰基可分別作為氫鍵供體和受體與CDK4鉸鏈區(qū)Val96形成氫鍵（見圖1）。Fascaplysin與CDK4的結(jié)合動力學計算結(jié)果證實，F(xiàn)ascaplysin的芳環(huán)平面中帶正電荷的季氮對其與CDK4的ATP結(jié)合口袋之間的庫侖力有重要貢獻，因此這一基團對Fascaplysin的選擇性起至關(guān)重要的作用[20]。

圖1 Fascaplysin與CDK4結(jié)合模型Figure 1 Binding model of Fascaplysin to CDK4

2 Fascaplysin的全合成

自發(fā)現(xiàn)Fascaplysin以來，人們一直在探索其全合成路線。20世紀90年代初，Gribble等( J Org Chem,1992年)首次報道了Fascaplysin的全合成（見圖2），其以吲哚為原料，先通過草酰氯合成出雙吲哚結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過環(huán)合、氧化，共5步反應，得到目標產(chǎn)物，總收率為33%。該合成路線較長，收率低，且反應中需用到草酰氯和氫化鈉，對無水操作要求較高。

圖2 Gribble等報道的Fascaplysin全合成路線Figure 2 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Gribble et al

隨 后，Rocca等(Tetrahedron Lett,1993年) 報 道 了Fascaplysin的第2條全合成路線（見圖3），該合成路線突破了使用吲哚的局限，以酰胺取代的苯硼酸和鹵素取代的吡啶為起始原料，經(jīng)4步反應，合成目標產(chǎn)物，縮短了合成路線，并提高了收率，最終收率達75%，但原料和試劑較為昂貴，合成成本提高。

圖3 Rocca等報道的Fascaplysin全合成路線Figure 3 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Rocca et al

Molina等(Tetrahedron Lett,1994年) 則采用Wittig反應，成功合成了Fascaplysin（見圖4），4步反應的最終收率約28%。其中最后一步，通過Sandmeyer反應，合成出季銨鹽結(jié)構(gòu)，同時將脫保護基和脫羧反應并為一步進行，將氨基制成重氮鹽形式。然而，該合成路線雖然較短，但起始原料不易制得，限制了此合成方法的應用。

圖4 Molina等報道的Fascaplysin全合成路線Figure 4 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Molina et al

Radchenko等(Tetrahedron Lett,1997年)也報道了一條新的Fascaplysin全合成路線（見圖5），該路線以色胺和鄰溴苯乙酸為原料，縮合成酰胺后，在三氯氧磷作用下環(huán)合，形成二氫咔啉結(jié)構(gòu)，再以二氧化錳脫氫，同時將咔啉1位亞甲基氧化成羰基，最后在220 ℃高溫下將化合物熔融，致N原子發(fā)生親核反應而環(huán)合，最終收率為44%。該合成方法中的原料易得，但最后一步的溫度較高，在熔融時原料會升華和碳化。筆者在進行該步反應時，曾嘗試用二苯醚作為溶劑，結(jié)果，此單步反應收率從40%提高到94%。

圖5 Radchenko等報道的Fascaplysin全合成路線Figure 5 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Radchenko et al

2010年，Zhidkov等[21]報道了2條類似的Fascaplysin全合成路線（見圖6），分別通過3步和4步反應得到終產(chǎn)物，收率均為30%。這2條合成路線巧妙地利用Borsche-Drechsel反應合成出Fascaplysin的B環(huán)，而最后季銨鹽結(jié)構(gòu)的制備方法與Gribble等首次報道的合成路線相同。

圖6 Zhidkov等報道的Fascaplysin全合成路線Figure 6 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Zhidkov et al

2012年，Bharate等[22]發(fā)現(xiàn)一條簡單的Fascaplysin全合成路線（見圖7），即以色胺和鄰氯苯乙二醛為原料，通過2步反應合成目標產(chǎn)物，總收率為68%。該合成路線的第1步便將Radchenko等報道的合成路線中前3步縮短為1步，通過Pictet-Spengler反應，并在鈀炭催化下脫氫，合成出Fascaplysin的C環(huán)，提高了總收率。但當苯乙二醛的苯環(huán)上有吸電子基團或苯環(huán)換成缺電子芳環(huán)時，苯乙二醛的制備會變得較為困難。

圖7 Bharate等報道的Fascaplysin全合成路線Figure 7 Total synthesis route of Fascaplysin reported by Bharate et al

2013年，Zhidkov等[23]又報道，以β-咔啉為原料，在微波條件下，通過Minisci反應，可得到合成Fascaplysin的重要中間體（見圖8），單步收率為65%。另外，Zhu等[24]以色胺和鄰溴苯乙酮為原料，在碘和過氧化氫催化下也得到該中間體（見圖9），收率達96%。這2種方法均以易得到的苯甲醛代替了苯乙二醛，有利于合成E環(huán)為缺電子環(huán)的Fascaplysin衍生物。

圖8 Zhidkov等報道的Fascaplysin重要中間體合成方法Figure 8 Synthesis strategy of the important intermediate of Fascaplysin reported by Zhidkov et al

圖9 Zhu等報道的Fascaplysin重要中間體合成方法Figure 9 Synthesis strategy of the important intermediate of Fascaplysin reported by Zhu et al

3 Fascaplysin的結(jié)構(gòu)改造

為了尋找活性更好、毒副作用更小的Fascaplysin衍生物，目前對Fascaplysin的結(jié)構(gòu)改造主要有2種思路。其中一種是，保留Fascaplysin的五環(huán)母核，在母核上引入不同取代基[25]。此思路針對的改造部位主要集中在Fascaplysin的3和10位，取代基以鹵素最為常見。2007年，Zhidkov等[2]首次合成了3和10位分別及同時溴代的Fascaplysin衍生物（2a～2c），2010年，Kuzmich等[26]則對3和10位分別溴代的Fascaplysin衍生物（2a和2b）進行了生物活性測試，結(jié)果，采用 MTS法進行的細胞活力檢測顯示，這2個衍生物對多種腫瘤細胞株均具有納摩爾級的抑制活性（見表1）。

表1 MTS法所測衍生物2a和2b對各種腫瘤細胞株的抑制活性Table 1 Inhibitory activities of derivatives 2a and 2b on different tumor cell lines determined by the MTS method

對Fascaplysin的另一種改造思路是，通過開環(huán)破壞其母核的平面結(jié)構(gòu)，減弱其對DNA的嵌合作用，以降低毒性。此思路針對的改造部位主要集中在Fascaplysin的C和D環(huán)上。Garcia等[27]將Fascaplysin的D環(huán)打開，合成了1位取代的咔啉類化合物（3），其對CDK4的IC50為39 μmol·L-1。由于D環(huán)打開后，C與E環(huán)的相對位置發(fā)生了扭轉(zhuǎn)，羰基及咔啉環(huán)上的NH可與CDK4鉸鏈區(qū)形成氫鍵，而與羰基連接的苯環(huán)則伸向CDK4 Phe93處一個特殊的π鍵堆積口袋（π-stacking pocket）內(nèi)側(cè)，并與該區(qū)域形成較強的π—π絡(luò)合作用，然而，這類化合物對CDK4的抑制活性較Fascaplysin降低20～50倍。為增強這類化合物的活性，該研究小組將化合物伸向CDK4 π鍵堆積口袋內(nèi)的苯環(huán)換成聯(lián)苯，結(jié)果，所得化合物4對CDK4的抑制活性（IC50=77 μmol·L-1）反而繼續(xù)下降，推測可能是由于聯(lián)苯基團體積過大所致。

Aubry等[28]則嘗試將Fascaplysin的C和D環(huán)均打開，合成了3個衍生物（5a～5c），但活性測試結(jié)果顯示，它們對CDK4的抑制活性均較Fascaplysin下降100倍左右，IC50分別為 70、50 和 50 μmol·L-1。

此后，該研究小組又進一步對Fascaplysin進行結(jié)構(gòu)改造，合成了以化合物6、7和8為母核的3個系列衍生物，并通過活性測試，篩選出活性較好的衍生物CA224（9）和CA199（10）。

DNA嵌合試驗顯示，即使在100 μmol·L-1的高濃度下，CA224和CA199也均無對DNA的嵌合作用，而Fascaplysin就是在5.5 μmol·L-1的低濃度時也會與DNA嵌合。且CA224和CA199對CDK4的IC50分別為6和20 μmol·L-1，而對CDK2的抑制活性較低，IC50均大于500 μmol·L-1，可見它們較好地保留了Fascaplysin的選擇性抑制活性。細胞活性實驗顯示，CA199有效抑制多種腫瘤細胞株生長的濃度在10～40 μmol·L-1范圍內(nèi)，其能將細胞周期阻滯在G0/G1期；CA224也對多種癌細胞株具有較好的抑制活性，其中對LS174T結(jié)腸癌細胞株和A549肺癌細胞株的IC50達3.5 μmol·L-1，對PC3前列腺癌細胞株的IC50為6.2 μmol·L-1。另外，從計算機模擬的CA224與CDK4結(jié)合模型（見圖10）可見，CA224中的聯(lián)苯結(jié)構(gòu)可伸入CDK4的π鍵堆積口袋，增強了其與該區(qū)域的結(jié)合力，而其對CDK2的IC50則為521 μmol·L-1。不過，研究表明，當CA224中二聯(lián)苯結(jié)構(gòu)擴增至三聯(lián)苯時，其活性下降6倍[19,29-31]。

圖10 CA224與CDK4結(jié)合模型Figure 10 Binding model of CA224 to CDK4

接著，該研究小組又嘗試將Fascaplysin的C環(huán)上12a與12b之間的碳碳鍵打開，設(shè)計合成了2個系列的雙吲哚類衍生物（11a～11j和12a～12e），其中系列化合物11中11i和11j對CDK4的IC50分別為38和44 μmol·L-1。對系列化合物12的雙吲哚之間碳鏈長度與其活性的關(guān)系研究顯示，當碳鏈長度大于2個碳原子時，隨著碳鏈增長，化合物活性遞減（見表2）[32]。

表2 系列化合物12的雙吲哚之間碳鏈長度與其活性的關(guān)系Table 2 Relationship between the coupling carbon chain lengths of indole-indole in compounds 12 and their activities

4 結(jié)語

Fascaplysin作為海洋天然產(chǎn)物具有特殊的五環(huán)結(jié)構(gòu)，能高效選擇性抑制抗腫瘤靶標CDK4激酶，這激發(fā)了人們以Fascaplysin為先導化合物研究與開發(fā)抗腫瘤藥物的熱情。近年來，對Fascaplysin的結(jié)構(gòu)改造主要是破壞其五環(huán)母核，以降低其對DNA的嵌入能力，從而減少其毒副作用，但這種改造策略也同時會對其活性和選擇性產(chǎn)生較大影響。筆者認為，F(xiàn)ascaplysin的五環(huán)結(jié)構(gòu)是其能選擇性抑制CDK4的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在保留其五環(huán)母核的基礎(chǔ)上，通過引入側(cè)鏈的方式降低其對DNA的嵌合作用，可能為其結(jié)構(gòu)改造策略的更優(yōu)選擇。另外，F(xiàn)ascaplysin與CDK4結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)尚無報道，這也限制了對Fascaplysin的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。相信隨著對Fascaplysin與CDK4結(jié)合模式探索的深入，開發(fā)選擇性CDK4抑制劑定會有新的突破。

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