Notch-RBP-J 信號(hào)通路對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10與小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞極化影響的研究

吳瓊 陳浩 周武慶 李阿梅 呂雅琳 胡彬 姜祎群 孫建方

·論著·

Notch-RBP-J 信號(hào)通路對(duì)小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10與小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞極化影響的研究

吳瓊 陳浩 周武慶 李阿梅 呂雅琳 胡彬 姜祎群 孫建方

目的探討小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10與小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)中Notch-RBP-J信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞表型分化的影響。方法設(shè)計(jì)針對(duì)CBF1/RBP-Jκ基因的siRNA編碼序列，轉(zhuǎn)染至小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分4組：沉默前共培養(yǎng)組，B16F10細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)；沉默后共培養(yǎng)組，B16F10細(xì)胞與RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)；空白對(duì)照組，單獨(dú)培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞；陽性對(duì)照組，白細(xì)胞介素4刺激誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞。Western印跡法、ELISA法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞的表型；RT-PCR法檢測(cè)各組notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表達(dá)。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析及單因素方差分析、線性趨勢(shì)檢驗(yàn)、Bonferroni兩兩比較。結(jié)果Western印跡結(jié)果顯示，RAW264.7與B16F10共培養(yǎng)不同時(shí)間后，RAW264.7細(xì)胞的CD163在空白對(duì)照組、共培養(yǎng)24 h、48 h、72 h組、陽性對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為1.016± 0.018、1.274±0.034、2.065±0.094、3.615±0.144、3.099±0.071，經(jīng)單因素方差分析（n=4），F(xiàn) =527.42，P ＜0.01，共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞CD163表達(dá)量較空白對(duì)照組增加；ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)24、48、72 h，RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液白細(xì)胞介素10的水平分別為（167.610±3.527）、（433.433 ± 5.558）、（679.673 ± 8.101） ng/L。沉默后共培養(yǎng) 24、48、72 h，RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液白細(xì)胞介素10表達(dá)量分別為（63.403± 0.856）、（103.427± 2.072）、（202.297± 3.610）ng/L，較未沉默時(shí)降低（F=8.01，P＜0.05）。Western印跡法及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)沉默后共培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞CD163、CD206的表達(dá)量，均較未沉默時(shí)減少（P＜0.05）。RT-PCR示，沉默后共培養(yǎng)組較沉默前共培養(yǎng)組及對(duì)照組的Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)均降低。結(jié)論沉默Notch-RBP-J信號(hào)通路后共培養(yǎng)組中RAW264.7細(xì)胞向M2型極化較未沉默共培養(yǎng)組減少，總體表型仍為M2型；該通路的活化促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向M2型極化。

Notch-RBP-J信號(hào)通路；巨噬細(xì)胞極化；共同培養(yǎng)技術(shù)

巨噬細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)炎癥中的一種主要細(xì)胞，然而，在大多數(shù)實(shí)體瘤中，巨噬細(xì)胞的存在有利于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociated macrophages，TAM）通過產(chǎn)生白細(xì)胞介素10（IL-10）以及腫瘤生長(zhǎng)因子 β（TGF-β）來抑制抗腫瘤的免疫反應(yīng)，同時(shí)可能通過分泌前血管生成因子促進(jìn)腫瘤的血管新生，并通過改變腫瘤微環(huán)境協(xié)助腫瘤的轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散［1-2］。巨噬細(xì)胞根據(jù)環(huán)境不同大致可極化為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（M1型）及替代活化型巨噬細(xì)胞（M2型）［3］。M1型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，殺滅細(xì)胞內(nèi)微生物及腫瘤細(xì)胞，并釋放大量促炎因子；M2型巨噬細(xì)胞參與誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，清除殘留物，促進(jìn)血管生成，參與組織重塑和修復(fù)，并具有促腫瘤的作用［4］。M1型及M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤中的作用截然相反。在腫瘤組織內(nèi)，巨噬細(xì)胞受到腫瘤微環(huán)境多種因素的影響，獲得TAM表型，表現(xiàn)出M2型巨噬細(xì)胞的特性［5］。本研究旨在通過共培養(yǎng)小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10及小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，觀察共培養(yǎng)對(duì)巨噬細(xì)胞表型的影響，探討發(fā)生影響的機(jī)制。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑與耗材：RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、Trizol及轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)自美國Invitrogen公司，牛血清產(chǎn)自美國ExCell Biology公司；流式抗體CD206產(chǎn)自美國ebioscience公司，兔抗人CD163抗體產(chǎn)自博奧森公司，IL-10及IL-4、IL-12、RT-PCR試劑盒產(chǎn)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；6孔Transwell板產(chǎn)自美國Corning公司。

2.細(xì)胞系：B16F10細(xì)胞系來自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心，本所中心實(shí)驗(yàn)室保存；RAW264.7細(xì)胞來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：沉默前共培養(yǎng)組：B16F10細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)；沉默后共培養(yǎng)組：B16F10細(xì)胞與RBP-Jκ基因沉默后的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)；空白對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞；陽性對(duì)照組：白細(xì)胞介素4刺激誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)Gene bank中CBF1/RBP-Jκ基因的序列，針對(duì)不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)20nt左右的siRNA序列，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR檢測(cè)沉默效率。

3.B16F10與RBP-Jκ基因沉默前后的RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)：在孔徑0.4 μm的transwell小室下室接種沉默前后的RAW264.7細(xì)胞（5×104個(gè)/孔）過夜，待細(xì)胞貼壁后，上室接種B16F10細(xì)胞（104個(gè)/孔），分別共培養(yǎng)24、48、72 h后，吸取下室培養(yǎng)基檢測(cè)沉默前后的RAW264.7表型的變化，并收集細(xì)胞。

4.IL-4刺激誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞：誘導(dǎo)前1 d，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不含抗生素的培養(yǎng)基，細(xì)胞密度30%～50%，過夜貼壁后用含有50 μg/L IL-4的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

5.Western印跡法檢測(cè)共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞表型：提取各組總蛋白，常規(guī)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用Gel-Pro32軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

6.ELISA法檢測(cè)共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞表型：共培養(yǎng)后收集RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基，離心取上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IL-10、IL-12的表達(dá)。

7.流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)后RAW264.7細(xì)胞表型：胰酶消化計(jì)數(shù)，5×105個(gè)/管，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌 1 次，100 μl PBS重懸，加 1 μg抗體，4 ℃共育30 min，PBS洗去游離的抗體，用0.5 ml PBS重懸后，流式細(xì)胞儀FACSCalibu檢測(cè)。

8.RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞 notch1、notch2、DLL1、DLL4及Hes1的表達(dá)：Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照說明書進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。Notch1 上游引物：5′-CCTGCCACTATGGTTCC TGT-3′，下游引物：5′-GGGTTGGACTCACACTCGT T-3′；Notch2 上游引物：5′-ACCCTTGTATGCACGGA GTC-3′，下游引物：5′-CCAGGTTATTGCACGTTCC T-3′；DLL1 上游引物：5′-TGCAGGAGTTCGTCAAC AAG-3′，下游引物：5′-CTCCCCTGGTTTGTCACAG T-3′；DLL4 上游引物：5′-GCCTCTCGAACTTGGACT TG-3′，下游引物：5′-AGCTCCTGCTTAATGCCAAA-3′；Hes1 上游引物：5′-GGTGCTGATAACAGCGGAAT-3′，下游引物：5′-ATGCCGGGAGCTATCTTTCT-3′。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行重復(fù)測(cè)量及單因素方差分析、線性趨勢(shì)檢驗(yàn)、Bonferroni兩兩比較，數(shù)據(jù)以±s表示。

結(jié) 果

一、RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間后CD163的變化

RAW264.7細(xì)胞的CD163在空白對(duì)照組、共培養(yǎng)24、48、72 h組、陽性對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為1.016 ± 0.018、1.274 ± 0.034、2.065 ± 0.094、3.615 ±0.144、3.099 ± 0.071，經(jīng)單因素方差分析（n=4），F(xiàn)=527.42，P＜0.01，CD163表達(dá)在共培養(yǎng)組隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量增加（圖1）。

二、Western印跡檢測(cè)RAW264.7與B16F10共培養(yǎng)后表型的變化

經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，沉默后與沉默前共培養(yǎng)組比較，RAW264.7細(xì)胞CD163表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=1.021，F(xiàn)=8.85，P＜ 0.05）；線性趨勢(shì)檢驗(yàn)示，在沉默后與沉默前兩組內(nèi)部 24、48、72 h 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，CD163的表達(dá)量成線性趨勢(shì)（n=1，F(xiàn)=18.99，P=0.007），隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量增加。見圖2、表1。

三、ELISA法檢測(cè)RAW264.7與B16F10共培養(yǎng)后 IL-10、IL-12 的變化

重復(fù)測(cè)量方差分析及線性趨勢(shì)檢驗(yàn)結(jié)果表明，沉默后與沉默前共培養(yǎng)組比較，IL-10表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在兩組內(nèi)部3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，IL-10的表達(dá)量成線性趨勢(shì)（n=1，F(xiàn)=15.20，P＜0.05），隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量增加。各組IL-12水平則無明顯改變（P＞0.05）。見表1。

四、流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAW264.7與B16F10共培養(yǎng)后CD206的變化

圖1 Western印跡檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間后CD163的變化 1：空白對(duì)照組；2～4：分別為共培養(yǎng)24 h、48 h、72 h； 5：陽性對(duì)照組

圖2 Western印跡檢測(cè)RAW264.7基因RBP-Jk沉默前后與B16F10共培養(yǎng)不同時(shí)間后CD163蛋白的變化 1：空白對(duì)照組；2～4：分別為RBP-Jk沉默前共培養(yǎng)24、48、72 h； 5 ～ 7：分別為RBP-Jk沉默后共培養(yǎng) 24、48、72 h

表1 RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間CD163相對(duì)表達(dá)量及IL-10、IL-12表達(dá)量、CD206熒光值的變化（±s）

表1 RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間CD163相對(duì)表達(dá)量及IL-10、IL-12表達(dá)量、CD206熒光值的變化（±s）

組別 CD163 IL-10（ng/L） IL-12（ng/L） CD206熒光值空白對(duì)照組 1.032±0.070 80.577±3.119 35.207±0.905 4.117±0.351 RBP-Jk沉默前24 h 2.235±0.110 167.610±3.527 36.617±1.599 13.063±0.805 48 h 3.243±0.091 433.433±5.558 35.883±1.414 20.630±1.555 72 h 4.259±0.160 679.673±8.101 37.207±2.258 26.947±1.095 RBP-Jk沉默后24 h 0.683±0.029 63.403±0.856 35.400±0.805 4.773±0.763 48 h 0.961±0.065 103.427±2.072 33.377±1.109 5.397±0.476 72 h 1.340±0.104 202.297±3.610 33.683±1.293 9.600±0.570 F值 8.85 8.01 1.85 8.82 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 ＜0.05自由度（n） 1.021 1.012 2.000 1.083

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)RAW264.7基因RBP-Jk沉默前后與B16F10共培養(yǎng)不同時(shí)間后CD206的變化 3a：對(duì)照組；3b～3d：RBP-Jk沉默前共培養(yǎng) 24、48、72 h； 3e ～ 3f：RBP-Jk沉默后共培養(yǎng) 24、48、72 h

圖4 RT-PCR法檢測(cè)RAW264.7基因RBP-Jk沉默前后與B16F10共培養(yǎng)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的變化 M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1～3：分別為對(duì)照組、沉默前、沉默后的內(nèi)參（GAPDH），352 bp； 4 ～ 6：分別為以上3組的Notch1，562 bp； 7 ～ 9：分別為以上3組的 Notch2，372 bp；10～12：分別為以上3組的DLL1，638 bp；13～15：分別為以上3組的DLL4，251 bp；16～18：分別為以上3組的Hes1，446 bp

表2 RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的變化（與GAPDH的比值，±s）

表2 RAW264.7細(xì)胞與B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的變化（與GAPDH的比值，±s）

注：n=2

組別 Notch1 Notch2 DLL1 DLL4 Hes1空白對(duì)照組 0.467±0.021 0.490±0.036 0.297±0.015 0.263±0.025 0.380±0.010 RBP-Jk沉默前 0.767±0.025 0.927±0.031 0.540±0.017 0.557±0.032 0.730±0.020 RBP-Jk沉默后 0.243±0.015 0.280±0.040 0.207±0.015 0.193±0.025 0.253±0.015 F值 477.41 255.50 349.09 145.41 748.14 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析及線性趨勢(shì)檢驗(yàn)，沉默后與沉默前共培養(yǎng)組比較，CD206表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且在兩組內(nèi)部，CD206的表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)成線性趨勢(shì)（n=1，F(xiàn)=20.362，P=0.006），隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量增加。見表1、圖3。

五、RT-PCR法檢測(cè)RAW264.7與B16F10共培養(yǎng)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的變化

單因素方差分析及兩兩比較結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、沉默前及沉默后組 Notch1、Notch2、DLL1、DLL4、Hes1相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且在沉默前共培養(yǎng)組的相對(duì)表達(dá)量均較空白對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在沉默后共培養(yǎng)組的相對(duì)表達(dá)量則較沉默前共培養(yǎng)組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖4。

討 論

M1型巨噬細(xì)胞由脂多糖（LPS）及干擾素γ（IFN-γ）誘導(dǎo)，產(chǎn)生誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）及細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、IL-1、IL-6 及高水平的IL-12等，而M2型巨噬細(xì)胞則由IL-4、IL-10及IL-13誘導(dǎo)，分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）、IL-1受體拮抗劑及高水平的IL-10等。巨噬細(xì)胞分泌的IL-12與IL-10的比例是區(qū)分M1及M2型的關(guān)鍵［6］。另外，M1 型巨噬細(xì)胞還表達(dá) CD16、CD32、iNOS，M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志為 CD206、CD163［7］。Notch信號(hào)通路是由Notch配體、受體及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子及調(diào)節(jié)分子構(gòu)成。哺乳動(dòng)物Notch受體包 括 Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，配 體 包 括Delta-like1、3、4（DLL1、3、4）及Jagged1、2（Jag1、2）［8］。Notch 受體活化后通過DNA結(jié)合蛋白CBF1/RBP-J發(fā)揮效應(yīng)，Notch信號(hào)激活HES轉(zhuǎn)錄因子，引起HES靶基因的抑制。有研究表明，Notch信號(hào)通路的活化促使巨噬細(xì)胞向M1型極化，并抑制向M2型極化，RBP-J介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞極化中起重要的作用［3］。

研究表明，巨噬細(xì)胞與乳腺癌或卵巢癌細(xì)胞體外共培養(yǎng)能夠增加腫瘤細(xì)胞的侵襲性［9］，那么，共培養(yǎng)體系中腫瘤細(xì)胞對(duì)于巨噬細(xì)胞會(huì)有何種影響呢？Hagemann等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠使巨噬細(xì)胞向具有TAM特性的表型分化。本研究采用小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7和小鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10共培養(yǎng)，免疫印跡法及ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，隨共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，RAW264.7細(xì)胞CD163表達(dá)量及上清IL-10水平逐漸增多，而上清IL-12水平無明顯改變。提示體外共培養(yǎng)體系中腫瘤細(xì)胞可使周圍的巨噬細(xì)胞向M2型極化。CBF1/RBP-J是活化Notch信號(hào)通路的重要蛋白，通過設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠RBP-Jκ基因的siRNA編碼序列，并轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞內(nèi)達(dá)到沉默Notch信號(hào)通路的目的。Notch信號(hào)通路沉默后共培養(yǎng)，ELISA示IL-12水平無顯著改變（P＞0.05），沉默后巨噬細(xì)胞向M1型分化未受明顯影響；IL-10表達(dá)量較未沉默時(shí)降低（P＜0.05），但水平仍高于IL-12；免疫印跡法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)示巨噬細(xì)胞CD163及CD206表達(dá)較未沉默時(shí)減少。提示RAW264.7細(xì)胞Notch信號(hào)通路沉默后與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)向M2型分化有所減少，但總體表型仍為M2型。既往有研究顯示，Notch信號(hào)通路的活化促使巨噬細(xì)胞向M1型極化，抑制向M2型極化［3］，依此進(jìn)行理論上的推斷，抑制Notch信號(hào)通路可能促進(jìn)向M2型極化并抑制向M1型極化。但重復(fù)實(shí)驗(yàn)并未出現(xiàn)推斷的結(jié)果，M2型極化并未增多，而M1型極化亦無顯著減少。分析出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能有以下兩方面：①Notch信號(hào)通路沉默后的共培養(yǎng)體系中RAW264.7細(xì)胞出現(xiàn)了除M1及M2型以外其他型別的分化，具體尚待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。Mosser等［11］認(rèn)為，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出的表型不固定，而是由特定的表型以不同的比例混合而成，從而表現(xiàn)出不同的活化狀態(tài)，其極化具有復(fù)雜性和多樣性；②除Notch信號(hào)通路外，可能還有其他信號(hào)通路影響著共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞的極化，如文獻(xiàn)中報(bào)道的JAK/STAT途徑［12］，M2分化成熟的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑（KLF4 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［13］，PPARs的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［14］）以及 Jmjd3 的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)途徑［15］。RTPCR法檢測(cè)沉默前后共培養(yǎng)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的變化，結(jié)果顯示，沉默前共培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞Notch信號(hào)通路活化程度較單獨(dú)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞增高，但沉默前共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞表型為M2型，而非M1型，與“Notch信號(hào)通路的活化促使巨噬細(xì)胞向M1型極化并抑制向M2型極化”并不一致。沉默后共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞表型雖然仍為M2型，但數(shù)量較沉默前有所減少，Notch信號(hào)通路的阻斷并未促進(jìn)共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞向M2型分化。Notch信號(hào)通路在TAM極化過程中到底起了何種作用？為進(jìn)一步探討Notch信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響中的作用，下一步的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃過度活化該通路，觀察該狀態(tài)下巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后的極化情況。

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2013-12-23）

（本文編輯：顏艷）

Effect of the Notch-RBP-J signaling pathway on the polarization of RAW264.7 murine macrophage-like cells cocultured with B16F10 murine melanoma cells

Wu Qiong,Chen Hao,Zhou Wuqing,Li Amei,Lyu Yalin,Hu Bin,Jiang Yiqun,Sun Jianfang.Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s；Jiang Yiqun,Email；yiqunjiang@qq.com；Sun Jianfang,Email；sunjf57@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of the Notch-RBP-J signaling pathway on the phenotypic differentiation of RAW264.7 murine macrophage-like cells cocultured with B16F10 murine melanoma cells.MethodsA small interference RNA （siRNA）targeting the CBF1/RBP-Jκ gene was designed.RAW264.7 murine macrophage-like cells were divided into four groups；unsilenced co-culture group cocultured with B16F10 cells,silenced co-culture group transfected with the designed siRNA and cocultured with B16F10 cells,blank control group cultured alone,positive control group induced by interleukin-4 （IL-4）.After additional culture for different durations,Western blot,enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and flow cytometry were conducted to determine the phenotype of macrophages,and reverse transcription （RT）-PCR was performed to detect the expressions of notch1,notch2,DLL1,DLL4 and Hes1 genes in macrophages.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance （ANOVA）,repeated measures ANOVA,linear trend test and the Bonferroni method with the SPSS17.0 software.ResultsWestern blot showed that the relative expression level of CD163 in RAW264.7 cells was 1.016±0.018 in the blank control group,1.274±0.034,2.065±0.094 and 3.615±0.144 in the unsilenced co-culture group at 24,48 and 72 hours respectively,and 3.099±0.071 in the positive control group,with significant differences between these groups （n=4,F=527.42,P＜ 0.01）.There was a significant increase in CD163 expression in RAW264.7 cells in the unsilenced co-culture group compared with the blank control group.As ELISA revealed,the levels of IL-10 in the culture supernatant of RAW264.7 cells were（167.61±3.527）,（433.433 ± 5.558） and（679.673 ± 8.101） ng/L in the unsilenced co-culture group at 24,48,and 72 hours respectively,significantly higher than those in the silenced co-culture group（（63.403 ± 0.856）,（103.427 ± 2.072）,（202.297 ± 3.61） ng/L,respectively,F=8.01,P＜ 0.05）.Western blot and flow cytometry both demonstrated a statistical reduction in the expressions of CD163 and CD206 in RAW264.7 cells in the silenced co-culture group compared with the unsilenced co-culture group（bothP ＜ 0.05）.The mRNA expressions of notch signaling pathwayrelated genes in RAW264.7 cells were also attenuated in the silenced co-culture group in comparison with the unsilenced co-culture group.ConclusionsAlthough most of the RAW264.7 cells in the silenced co-culture group exhibited the M2 phenotype,their polarization toward M2 phenotype was weakened compared with those in the unsilenced co-culture group,implying that the activation of the Notch-RBP-J signaling pathway promotes the M2-polarization of RAW264.7 cells.

Notch-RBP-J signaling pathway；Macrophage polarization；Coculture techniques

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.001

國家自然科學(xué)基金（81102067）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年基金（5201-01-6068）

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所

姜祎群，Email：yiqunjiang@qq.com；孫建方，Email：sunjf57@163.com